小花矮牽牛原生質(zhì)體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種小花矮牽牛原生質(zhì)體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 小花矮牽牛（Calibrachoahybrid)又名舞春花，是前科Calibrachoa屬草本花 卉，因花色豐富、花型優(yōu)美，花期長及花量大，株型叢狀緊湊，對介質(zhì)中高PH值有很好的耐 性等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于城市園林綠化，商業(yè)發(fā)展?jié)摿薮?。同時還可作為育種資源，與其它 植物進(jìn)行原生質(zhì)體融合培育新品種，特別是可為黃色矮牽牛的培育開辟一條新的途徑。
[0003] 酶液種類和比例、滲透壓、酶解時間、預(yù)處理方式及純化方法等因素影響植物原生 質(zhì)體的分離。目前有關(guān)小花矮牽牛原生質(zhì)體分離研究較少，Power (1980)等利用4wt%纖 維素酶+2wt%半纖維素酶+0. 3wt%離析酶分離小花矮牽牛葉片，酶解過程所需時間較長； Meyer(2009)利用2%纖維素酶+0.6wt%離析酶分離經(jīng)過預(yù)質(zhì)壁分離小花矮牽牛葉片，酶 解時間15h，漂浮法純化原生質(zhì)體，原生質(zhì)體產(chǎn)量約為2.3X106個/g，活性可達(dá)80%以上。 不同物種同一物種不同品種原生質(zhì)體分離差異較大，有關(guān)小花矮牽牛原生質(zhì)體分離效率不 高，且分離時間較長。本發(fā)明建立了一套完善的分離體系，分離時間縮短，原生質(zhì)體產(chǎn)量增 加，原生質(zhì)體純化方式簡便，可重復(fù)性好，極大的提高了小花矮牽牛原生質(zhì)體的分離效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種小花矮牽牛（Calibrachoa hybrid ' lindura yellow'）原生質(zhì)體的制備方法；該制備方法簡便，可高效制備原生質(zhì)體，且可重復(fù)性好。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 本發(fā)明所提供的制備原生質(zhì)體的方法，包括以下步驟：
[0007] (1)對葉片進(jìn)行預(yù)處理：在黑暗條件下，收集幼嫩葉片于3~5°C清水中進(jìn)行20~ 25h預(yù)處理；
[0008] (2)用酶解液酶解步驟（1)中處理后的葉片；所述酶解液的溶劑為0? 25M的磷酸 鹽溶液，溶質(zhì)為如下終濃度的物質(zhì)：2wt%的纖維素酶；0.8wt%的離析酶；0.2wt%的果膠 酶；0. llwt%的無水氯化f丐；0. 10wt%的牛血清白蛋白；所述酶解液的pH值為5. 6~5. 7;
[0009] (3)向步驟（2)的酶解結(jié)束后的溶液中加入和所述酶解液等體積的A溶液，輕輕搖 晃酶液，經(jīng)過300目細(xì)胞篩過濾后1100r/min離心2min，移液槍吸去上清液；A溶液為CPW 洗液，其中溶劑為CPW鹽溶液，溶質(zhì)為終濃度0. 25M的甘露醇；
[0010] (4)在經(jīng)過步驟（3)處理的體系中緩緩加CPW洗液洗滌，后在Centrifuge5810R 離心機(jī)1100r/min離心2min，吸去上清液，收集沉淀，即得原生質(zhì)體；
[0011] (5)在所述原生質(zhì)體中緩緩加入懸浮液，得到懸浮的原生質(zhì)體；所述懸浮液為含 0. 25M的甘露醇、4mMMES、0.lwt%KC1的水溶液，所述懸浮液的pH為5. 6~5. 7。
[0012] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述幼嫩葉片為頂芽下端第1~2片幼嫩葉片。
[0013] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述幼嫩葉片為剪成0. lcmXO. 2cm的條狀葉片。所述步驟3) 和4)中離心的試管均為50ml的大試管；所述步驟3)和4)中離心機(jī)的加速度為3。（離心 機(jī)加速度一般是指從〇轉(zhuǎn)到10000轉(zhuǎn)能力，共分1~9個等級。如加速度為1時表示從0 轉(zhuǎn)到10000轉(zhuǎn)所用時間較長，加速度為9表示從0轉(zhuǎn)到10000轉(zhuǎn)所用時間較短。）
[0014] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述磷酸鹽溶液是由每升水中加入Na2HP03 ? 12H20 10. 36g、 NaH2P0390. 56g制備而得；所述磷酸鹽溶液的pH為5. 6~5. 7。
[0015] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述酶解溫度為25~27°C，酶解時間為5h。在本發(fā)明中，酶 解時間是影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性的重要參數(shù)；在酶解的前期，原生質(zhì)體的產(chǎn)量隨著酶解 時間的增加而逐漸提高，在5h達(dá)到最高；超過5h后，原生質(zhì)體產(chǎn)量隨著酶解時間的增加而 降低，同時細(xì)胞碎片逐漸增多；而原生質(zhì)體的活性隨著時間的增加一直在降低；綜合原生 質(zhì)體產(chǎn)量和活性來看，5h為分離小花矮牽牛葉肉原生質(zhì)體的最佳時間。
[0016] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述纖維素酶為cellulaseR-10。
[0017] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述離析酶為macerozymeR-10。
[0018] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述果膠酶為pectolyaseY-23。
[0019] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述CPW鹽溶液是由每升水中加入KH2C0327. 2mg、 KN03101.Omg、CaC03 ? 2H20 1480mg、MgS04 ? 7H20 246.Omg、KIO. 16mg、CuS04 ? 5H200. 025mg制 備而得；所述CPW鹽溶液的pH為5. 6~5. 7。在調(diào)配CPW洗液時，需要用微量氫氧化鈉調(diào) 到5. 6~5. 7 ;從而不僅保證最初CPW鹽溶液是5. 6~5. 7,還保證含有甘露醇和其它物質(zhì) 最終的CPW洗液的PH值為5. 6~5. 7。
[0020] 作為優(yōu)選技術(shù)方案，所述小花矮牽牛品種為Calibrachoahybrid'lindura yellow'，花色黃色，購自Fides公司。
[0021] 本發(fā)明所用的纖維素酶CellulaseOnozuka R-10與離析酶Macerozyme R-10和 果膠酶Pectolyase Y-23的配比使用效果顯著。離析酶對原生質(zhì)體分離效果有顯著的影 響，在相同纖維素酶和果膠酶濃度下，隨離析酶濃度的提高，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性先增加后 緩慢降低，當(dāng)離析酶濃度在〇.8wt%時，分離效果尤佳，當(dāng)?shù)陀谶@個濃度時，原生質(zhì)體的產(chǎn) 量和活性均較低，這與離析酶分解植物組織中的果膠質(zhì)，將植物組織分離成單細(xì)胞的作用 有關(guān)；當(dāng)高于這個濃度時，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活性下降，這與高濃度離析酶對原生質(zhì)體產(chǎn)生 毒害和損傷，破壞了原生質(zhì)體的完整性有關(guān)。在所試驗(yàn)的酶液組合中，以2.Owt%纖維素 酶CellulaseOnozuka R-10+0. 2wt%果膠酶Pectolyase Y-23+0. 8wt%離析酶Macerozyme R-10的組合，原生質(zhì)體分離效果最好。
[0022] 本發(fā)明以甘露醇為滲透壓調(diào)節(jié)劑，不同甘露醇濃度調(diào)節(jié)的滲透壓影響原生質(zhì)體的 產(chǎn)量和活性，隨滲透壓逐漸升高，原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸降低，原生質(zhì)體活性則先增加后降低， 綜合考慮原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性，小花矮牽牛原生質(zhì)體分離的甘露醇適宜濃度為〇. 25M。
[0023] 本發(fā)明具有如下有益效果：
[0024] 1)本發(fā)明的方法是首先對葉片進(jìn)行低溫黑暗處理，用含0. 25M甘露醇+2.Owt%纖 維素酶+〇. 2wt%果膠酶+0. 8wt%離析酶的混合酶解液進(jìn)行酶解，酶解完成后，對原生質(zhì)體 進(jìn)行純化離心洗滌，最后用懸浮液懸浮，使之處于正常狀態(tài)。
[0025] 2)用本發(fā)明的方法可以明顯縮短分離時間減少對原生質(zhì)體的傷害，得到活性很高 的原生質(zhì)體，活性可達(dá)到85% ;與漂浮法比較純化原生質(zhì)體步驟簡便且損失較少，制備葉肉 原生質(zhì)體產(chǎn)量高，可達(dá)到（5. 0±0. 3)X106個/g，生長狀態(tài)良好。
[0026] 3)對通過此方法分離的原生質(zhì)體進(jìn)行培養(yǎng)及植株再生，可進(jìn)一步為其它植物原生 質(zhì)體融合獲得新品種提供育種材料。
【附圖說明】
[0027] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明的其它特征、 目的和優(yōu)點(diǎn)將會變得更明顯：
[0028] 圖1為實(shí)施例制備的小花矮牽牛葉肉原生質(zhì)體的圖片；
[0029] 圖2為在熒光顯微鏡下檢測實(shí)施例制備的小花矮牽牛葉肉原生質(zhì)體的活性圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員 進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干調(diào)整和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保 護(hù)范圍。
[0031] 本發(fā)明涉及一種小花矮牽牛原生質(zhì)體的制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0032] A、在黑暗條件下，將小花矮牽牛的幼嫩葉片進(jìn)行預(yù)處理；
[0033] B、用酶解液酶解步驟A處理后的葉片；所述酶解液的溶劑為0. 25M的磷酸鹽溶液， 溶質(zhì)為如下終濃度的物質(zhì)：2wt%的纖維素酶、0. 8wt%離析酶、0. 2wt%果膠酶、0.llwt%無 水氯化鈣、0.l〇wt%牛血清白蛋白；所述酶解液的pH為5. 6~5. 7;
[0034]C、向步驟B酶解結(jié)束后的溶液中加入和所述酶解液等體積的CPW洗液，搖晃酶液， 經(jīng)300目細(xì)胞篩過濾后1100r/min離心2min，吸去上清液；所述CPW洗液中溶劑為CPW鹽 溶液，溶質(zhì)為終濃度〇. 25M的甘露醇，CPW洗液的pH為5. 6~5. 7 ;
[0035] D、再次加入CPW洗液洗滌，1100r/min離心2min，吸去上清液，收集沉淀，即得原生 質(zhì)體；
[0036] E、在所述原生質(zhì)體中緩緩加入懸浮液，得到懸浮的原生質(zhì)體；所述懸浮液為含 0. 25M的甘露醇、4mMMES、0.lwt%KC1的水溶液，所述懸浮液的pH為5. 6~5. 7。
[0037] 針對步驟A中的預(yù)處理，本發(fā)明在預(yù)處理的過程中共設(shè)置了兩個預(yù)處理方式，具 體為在黑暗條件下用4°C清水對葉片進(jìn)行24h預(yù)低溫黑暗處理或把葉片置于含0. 55M甘露 醇CPW溶液中進(jìn)行l(wèi)h的預(yù)處理；具體見表1 :
[0038] 表1對外植體進(jìn)行預(yù)處理
[0039]
[0040] 預(yù)處理方式對原生質(zhì)體分離的影響：
[0041] 酶解前對材料進(jìn)行預(yù)處理，可改變細(xì)胞和細(xì)胞壁的生理狀態(tài)，增加細(xì)胞膜的強(qiáng)度， 提高細(xì)胞壁酶解的效率，減少原生質(zhì)體損失。上述兩組不同的預(yù)處理措施，用以研究其對葉 片制備原生質(zhì)體的影響，結(jié)果如表2所示。兩種不同預(yù)處理方法與對照相比，原生質(zhì)體產(chǎn)量 和活性均呈增大趨勢，但多重比較分析顯示兩種預(yù)處理之間并無顯著差異。當(dāng)把葉片置于 4°C黑暗條件下放置24h，酶解產(chǎn)量為5.知103個/g，活性達(dá)到87 %，均比經(jīng)預(yù)質(zhì)壁分離處理 和對照組得到的原生質(zhì)體結(jié)果好。因此，分離小花矮牽牛葉肉原生質(zhì)體最好的預(yù)處理方式 為3~5°C黑暗放置20~25h，更優(yōu)選4°C黑暗放置24h。
[0042] 表2不同預(yù)處理對原生質(zhì)體產(chǎn)量及活性的影響
[0043]
[0044] 針對步驟B中的酶解液，本發(fā)明在選擇酶液組分和濃度過程中，在2wt%纖維素 酶+0. 2wt%果膠酶的基礎(chǔ)上，共設(shè)置4個離析酶濃度，分別為0wt%，0. 4wt%，0. 8wt%， 1.2wt%。結(jié)果表明離析酶對于原生質(zhì)體分離效果起到非常明顯的作用，當(dāng)離析酶濃度為 0.8wt%時，原生質(zhì)體產(chǎn)量較高，活性較好。具體如下：
[0045] 酶液組合的選擇：
[0046] 酶液處理共設(shè)置4個組合，見表3。通過測定分離出原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活性，確定 適宜的最佳酶液組合。
[0047] 表3酶液處理組合