一種人胚胎滋養(yǎng)細胞和胎盤間充質(zhì)干細胞的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及一種人胚胎滋養(yǎng)細胞和胎盤間充質(zhì)干 細胞的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 常規(guī)分離方法通常難以獲得大量純度較高的滋養(yǎng)細胞和胎盤間充質(zhì)干細胞；應用 流式細胞儀分選法或磁珠分選法獲得的細胞雖然純度好，但成本很高。
[0003] 滋養(yǎng)細胞在體外培養(yǎng)和傳代比較困難，很多研究者都采用分離細胞后直接處理或 干預的方案，因此一次性獲得大量的滋養(yǎng)細胞對實驗進行是非常有利的。胎盤間充質(zhì)干細 胞在胎盤組織的豐度低，想獲得一定數(shù)量的原代細胞也需要很多的胎盤組織。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中，胎盤的細胞成分較復雜，其中所包含的滋養(yǎng)細胞在母胎免疫耐受過 程中起重要作用，胎盤間充質(zhì)干細胞具有多向分化潛能以及抑制淋巴細胞增殖的特性，常 規(guī)離方法通常難以獲得大量且純度較高的上述兩種細胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種人胚胎滋養(yǎng)細胞和 胎盤間充質(zhì)干細胞的生產(chǎn)方法，可以達到一次操作即可同時獲得大量、較高純度的人胚胎 滋養(yǎng)細胞和胎盤間充質(zhì)干細胞的目的。
[0006] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案為：
[0007] -種人胚胎滋養(yǎng)細胞和胎盤間充質(zhì)干細胞的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：
[0008] (1)胎盤標本處理：無菌條件下將娩出胎盤剝除羊膜，剪除胎盤母體面2.0~ 3. 0_組織后，剪下胎盤小葉，稱取50g，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗菌肽的 保存液是將10~100yg/ml多聚賴氨酸加入到10~100yg/ml沒食子酸酯EGCG中配制 而成，浸泡預定時間后，將剪下的胎盤小葉用手術(shù)剪剪碎，用生理鹽水反復沖洗血污，直至 沖洗液接近無色，得處理后的胎盤組織；
[0009] (2)組織消化：用15mmol/L三羥甲基氨基甲燒，加入哈特曼-D溶液，調(diào)節(jié)pH至 8. 0,作為消化緩沖液，加入終濃度為2. 4g/LHyQTase(購于HyClone公司）和300U/mL DNaseI組成的消化液，取消化液320mL，將沖洗后的胎盤組織分多次進行消化，每次在 37±0. 2°C、180r/min恒溫氣浴搖床消化2min，消化完畢后，無菌去除HyQTase溶液，用新生 牛血清終止消化反應，得到細胞懸液；
[0010] (3)密度梯度密度分離：在50mL離心管中逐層鋪入7個密度的Percoll分離液， 每個密度5mL，再緩緩加入5mL細胞懸液，使用水平離心機室溫下1200g離心20min，小心棄 除離心管20mL刻度以上的液體，收集12. 5~20.OmL刻度的細胞層和12. 5~7. 5mL刻度 的液體，在離心管15~20mL刻度處可見明顯的白色云霧狀細胞層，此處對應的Percoll相 對密度為1. 046~1. 059,是滋養(yǎng)細胞存在的區(qū)域；離心管10mL刻度附近可見不明顯的細 胞層，此處密度為1. 072,是淋巴細胞和胎盤間充質(zhì)干細胞存在的區(qū)域，分別放入不同離心 管里，用D-Hank's液稀釋5倍后，室溫下lOOOg離心15min;離心管底可見白色細胞團得梯 度密度分離后的滋養(yǎng)細胞和胎盤間充質(zhì)干細胞；
[0011] ⑷滋養(yǎng)細胞的獲得：用含體積分數(shù)為10%胎牛血清（FBS)的DMEM/F12、丙酮酸 鹽、10mg/L亞硒酸鈉胰島素、2mg/L乙醇胺和20毫yg/mL的bFGF配制成懸浮液，將密度梯 度離心后的滋養(yǎng)細胞進行重懸，用差速貼壁法去除成纖維細胞，獲得滋養(yǎng)細胞；經(jīng)計數(shù)，獲 得的滋養(yǎng)細胞量可達（5. 48±1. 98)X108個；
[0012] (5)胎盤間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)：用含體積分數(shù)為10 %胎牛血清（FBS)的DMEM/ F12、丙酮酸鹽、10mg/L亞硒酸鈉胰島素、2mg/L乙醇胺和20毫yg/mL的bFGF、增殖促進 劑配制成懸浮液，將密度梯度離心后獲得的胎盤間充質(zhì)干細胞進行重懸，在微重力環(huán)境下， 依次通過電磁場和聲波處理間充質(zhì)干細胞；計數(shù)并接種于75mm的培養(yǎng)瓶，在培養(yǎng)基中補充 4mg/ml堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)、10ng/mlN-乙?；?L-半胱氨酸、100ng/ml氯化 鈣，放入37°C、二氧化碳濃度為0. 5 %的C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2d換液1次，細胞生長至90 % 融合后，消化并計數(shù)細胞，按1 : 4比例傳代，細胞傳代后生長速度較快，細胞形態(tài)比較均 一，變化形態(tài)明顯的第2天用100ng/ml的BMP4處理，第3天或4用10ng/ml的BMP4處理， 第5天用lng/ml的BMP4處理，傳至第8代時細胞開始出現(xiàn)老化現(xiàn)象，細胞增殖緩慢，細胞 體積增大，胞漿中出現(xiàn)很多黑色顆粒，此時需要注入一種抗氧化劑，所述抗氧化劑為聚乙二 醇-綴合過氧化氫酶（PEG-過氧化氫酶）或N-乙酰半胱氨酸，或使用抗氧化物，所述抗氧 化物為l-500yM丙酮酸乙酯（EP)，抑制間充質(zhì)干細胞的衰老，用于增加干細胞產(chǎn)量，直到 傳至第九或十代。
[0013] 進一步地，所述增殖促進劑為凝結(jié)的臍帶血液的液體成分，以促進細胞生長。
[0014] 進一步地，所述微重力環(huán)境是通過多軸旋轉(zhuǎn)所形成的模擬微重力環(huán)境，可以獲得 具有更小的平均氣泡尺寸的間充質(zhì)干細胞。
[0015] 本發(fā)明的有益效果是：
[0016] (1)本發(fā)明采用HyQTase和DNAseI共同消化組織，經(jīng)梯度密度分離后，可同時一 次性獲得大量的滋養(yǎng)細胞和較多的胎盤間充質(zhì)干細胞，對細胞損傷小，所獲得細胞純度和 活力都比較理想；
[0017] (2)使用不連續(xù)梯度的Percoll細胞分離液可以去除消化碎片、成纖維細胞和紅 細胞，并把滋養(yǎng)細胞和胎盤間充質(zhì)干細胞區(qū)分開來；獲得的細胞滋養(yǎng)細胞在經(jīng)差速貼壁法 貼除成纖維細胞后，純度可達90 %，而且成本較低。
[0018] (3)密度梯度分離后獲得的胎盤間充質(zhì)干細胞在培微重力環(huán)境下，依次通過電磁 場和聲波處理間充質(zhì)干細胞，并注入一種抗氧化劑，一直可以傳代至第九或十代。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明實施例中各個濃度Percoll分布位置、相對密度和對應的細胞種類 圖；
[0020] 圖2為本發(fā)明實施例中梯度密度分離后接種培養(yǎng)的胎盤間充質(zhì)干細胞生長形態(tài) (X100)圖，A:第四代，B:第八代，C:第九代，D:第十代；
[0021] 圖3為本發(fā)明實施例中胎盤間充質(zhì)干細胞的成骨分化潛能（X100)圖，A:誘導實 驗組，B:對照組。
【具體實施方式】
[0022] 下面結(jié)合實驗室進行的具體試驗對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步詳細說明，但本發(fā) 明不限于以下列舉的特定例子。
[0023] -種人胚胎滋養(yǎng)細胞和胎盤間充質(zhì)干細胞的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：
[0024] (1)胎盤標本處理：無菌條件下將娩出胎盤剝除羊膜，剪除胎盤母體面2. 0mm組織 后，剪下胎盤小葉，稱取50g，浸泡于含有抗菌肽的保存液中，所述含有抗菌肽的保存液是將 10yg/ml多聚賴氨酸加入到10yg/ml沒食子酸酯EGCG中配制而成，浸泡預定時間后，將剪 下的胎盤小葉用手術(shù)剪剪碎，用生理鹽水反復沖洗血污，直至沖洗液接近無色，得處理后的 胎盤組織；
[0025] ⑵組織消化：用15mmol/L三羥甲基氨基甲燒，加入哈特曼-D溶液，調(diào)節(jié)pH至 8. 0,作為消化緩沖液，加入終濃度為2. 4g/LHyQTase(購于HyClone公司）和300U/mL DNaseI組成的消化液，取消化液320mL，將沖洗后的胎盤組織分多次進行消化，每次在 36. 8°C、180r/min恒溫氣浴搖床消化2min，消化完畢后，無菌去除HyQTase溶液，用新生牛 血清終止消化反應，得到細胞懸液；
[0026] (3)密度梯度密度分離：在50mL離心管中逐層鋪入7個密度的Percoll分離液， 每個密度5mL，如表1所示，再緩緩加入5mL細胞懸液，使用水平離心機室溫下1200g離心 20min，小心棄除離心管20mL刻度以上的液體，收集12. 5~20.OmL刻度的細胞層和12. 5~ 7. 5mL刻度的液體，在離心管15~20mL刻度處可見明顯的白色云霧狀細胞層，此處對應的 Percoll相對密度為1. 046~1. 059,是滋養(yǎng)細胞存在的區(qū)域；離心管10mL刻度附近可見不 明顯的細胞層，此處密度為1.072,是淋巴細胞和胎盤間充質(zhì)干細胞存在的區(qū)域，見圖1，分 別放入不同離心管里，用D-Hank's液稀釋5倍后，室溫下1000g離心15min;離心管底可 見白色細胞團得梯度密度分離后的滋養(yǎng)細胞和胎盤間充質(zhì)干細胞；
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[0028] (4)滋養(yǎng)