一種提高臍帶血巨核祖細胞體外誘導分化效率的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于細胞技術領域，具體涉及一種提高臍帶血巨核祖細胞體外誘導分化效 率的方法。
【背景技術】
[0002] 1989年世界上第一次進行臍帶血造血干細胞移植并獲得成功后，臍帶血造血干細 胞的臨床應用便越來越廣泛，經(jīng)過20多年的發(fā)展，目前臍帶血已經(jīng)和骨髓、外周血一起成 為造血干細胞的三大來源。
[0003] 相對于骨髓，臍帶血移植后血小板的恢復速度稍慢一些，目前普遍認為原因是臍 帶血中的巨核祖細胞數(shù)量不充裕且分化成熟遲緩。由于在造血干細胞移植前，受者通常要 進行大劑量放療/化療以達到清髓效果，而放療/化療會使受者的造血系統(tǒng)嚴重受損，導致 一段時間內(nèi)血小板嚴重缺乏，容易出血甚至引起死亡，所以需要輸注大量外源的血小板。而 在造血干細胞移植后，血小板的恢復情況也是影響移植成敗的重要原因。所以，對于臍帶血 移植而言，血小板的作用巨大。
[0004] 造血干細胞具有自我更新能力并能最終分化為各種血液成分細胞。造血干細胞可 分化為巨核祖細胞（Megakaryocyticprogentitorcell，MKPC)，然后進一步分化為成熟的 巨核細胞，最終釋放出血小板。近年研究發(fā)現(xiàn)，將異體臍帶血造血干細胞在體外定向擴增 為巨核祖細胞，造血干細胞移植時在需要的時候輸注到移植受者體內(nèi)，是有可能解決放療/ 化療后血小板缺乏和臍帶血移植后血小板恢復延遲的重要臨床方法。
[0005] 由于臍帶血的造血干細胞的含量比例低于骨髓，而且臍帶血中的巨核祖細胞數(shù)量 較少成熟遲緩，所以如何提高臍帶血造血干細胞向巨核祖細胞定向分化的效率具有實際的 臨床意義。當前，臍帶血造血干細胞體外巨核祖細胞定向擴增普遍采用的細胞因子組合進 行擴增，主要有IL-3,IL-6,SCF，TPO,FLT等。
[0006] 白藜蘆醇是一種天然的植物抗體，存在于葡萄科、百合科、豆科等70多種植物中， 當植物遭遇到真菌感染、紫外線等不利條件時產(chǎn)生的酚類化合物，對植物起保護、防御作 用。在醫(yī)學上，白藜蘆醇的抗心血管疾病作用因"法國悖論"而始被學者們認識，隨著世界 范圍內(nèi)的進一步研究，白藜蘆醇在抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗衰老等方面的生物學作用逐漸被 發(fā)現(xiàn)。在造血干細胞的分化方面，白藜蘆醇可加速紅系祖細胞的成熟，在體外擴增時提高 CFU-GM的集落生成數(shù)量。
[0007] 隨著分子生物學及信號通道的深入研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇對MAPK或NF-kB信號通道 有明顯的作用效果，在癌細胞方面，如Hela細胞、MCF-7細胞等，通過較高濃度的白藜蘆醇 處理（60ymol/L)，可促使p38MAPK信號通道激活，從而致使癌細胞凋亡。p38MAPK信號通 道還參與了多種細胞因子及其生理作用過程的信號傳導，但不同類型細胞對于P38MAPK信 號通道有不同的敏感程度，鑒于白藜蘆醇對P38MAPK信號通道的作用，可以用白藜蘆醇來 歧化不同類型的細胞，從而達到優(yōu)化培養(yǎng)的效果。
[0008] 臍帶血采集后去除血漿和紅細胞，得到富含造血干細胞的總有核細胞（TNC)?？傆?核細胞含有大量各種類型的細胞，復雜的成分對造血干細胞體外擴增和分化的效率有不良 影響。雖然通過磁珠分選可獲得較純的造血干細胞，優(yōu)化體外擴增和分化的結果，但成本的 大幅度增加對于大量擴增需要的情況有極大制約，同時更多的操作步驟也帶來更大的污染 風險。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了克服現(xiàn)有技術的不足與缺點，本發(fā)明首要目的在于提供一種提高臍帶血巨核 祖細胞體外誘導分化效率的方法，該方法制備過程簡單、可靠且重復性好，污染可能性低， 兼顧了制備成本的經(jīng)濟性和操作安全性，為臨床應用提供了更可靠的支持。
[0010] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：
[0011] 一種提高臍帶血巨核祖細胞體外誘導分化效率的方法，包含如下步驟：
[0012] 以臍帶血造血干細胞為標本細胞，使用I型干細胞培養(yǎng)基進行首階段培養(yǎng)72小 時，然后更換II型干細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，通過這兩種不同成分的干細胞培養(yǎng)基的先后培 養(yǎng)順序組合，顯著提高了臍帶血造血干細胞向巨核祖細胞定向分化的效率；
[0013] 所述的I型干細胞培養(yǎng)基為含有終濃度50ymol/L白黎蘆醇的干細胞培養(yǎng)基；
[0014] 所述的I型干細胞培養(yǎng)基優(yōu)選為含有終濃度50ymol/L白黎蘆醇、人白細胞介 素-3 (Interleukin-3,IL-3)、人白細胞介素-6 (Interleukin-6,IL-6)、人干細胞生長因子 (Stemcellfactor，SCF)和促血小板生成素（Thrombopoietin，TP0)的造血干細胞培養(yǎng) 基；
[0015] 所述的I型干細胞培養(yǎng)基中，IL-3、IL-6、SCF和TP0的終濃度分別優(yōu)選為20ng/ mL、50ng/mL、50ng/mL和 50ng/mL;
[0016] 所述的造血干細胞培養(yǎng)基優(yōu)選為Stemspan培養(yǎng)基（STEMCELL公司）；
[0017] 所述的II型干細胞培養(yǎng)基為不含任何白藜蘆醇成分的干細胞培養(yǎng)基；
[0018] 所述的II型干細胞培養(yǎng)基優(yōu)選為不含任何白藜蘆醇成分但含有人白細胞介 素-3 (Interleukin-3,IL-3)、人白細胞介素-6 (Interleukin-6,IL-6)、人干細胞生長因子 (Stemcellfactor，SCF)和促血小板生成素（Thrombopoietin，TP0)的造血干細胞培養(yǎng) 基；
[0019] 所述的II型干細胞培養(yǎng)基中，IL-3、IL-6、SCF和TP0的終濃度分別優(yōu)選為20ng/ mL、50ng/mL、50ng/mL和 50ng/mL;
[0020] 所述的造血干細胞培養(yǎng)基優(yōu)選為Stemspan培養(yǎng)基（STEMCELL公司）；
[0021] 所述的繼續(xù)培養(yǎng)的時間優(yōu)選為1~11天；
[0022] 所述的提高臍帶血巨核祖細胞體外誘導分化效率的方法，優(yōu)選包含如下具體步 驟：
[0023] (1)配制培養(yǎng)基：將白藜蘆醇溶于細胞保護劑中，得到白藜蘆醇儲存溶液；然后將 白藜蘆醇儲存溶液添加到干細胞培養(yǎng)基中，得到I型干細胞培養(yǎng)基；
[0024] (2)誘導分化：將臍帶血造血干細胞接種于步驟（1)制備得到的I型干細胞培養(yǎng) 基，首階段培養(yǎng)72小時；
[0025] (3)繼續(xù)培養(yǎng)階段：將步驟⑵中培養(yǎng)后的細胞離心去上清，接種于II型干細胞 培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)；
[0026] 步驟⑴中所述的白藜蘆醇的純度彡99%，GC;
[0027] 步驟⑴中所述的白藜蘆醇儲存溶液濃度為10mm〇l/L，該濃度為儲存濃度，工作 濃度跟儲存濃度一致，須放置于4°C遮光保存；
[0028] 步驟（1)中所述的細胞保護液為含有體積百分比為55%二甲基亞砜（DMS0)和體 積百分比為5%低分子右旋糖酐（Dextran)的注射用水溶液；
[0029] 步驟（1)中所述的I型干細胞培養(yǎng)基為含有終濃度50ymol/L白黎蘆醇的干細胞 培養(yǎng)基；
[0030] 步驟（1)中所述的I型干細胞培養(yǎng)基優(yōu)選為含有終濃度50ymol/L白黎蘆醇、人 白細胞介素 _3 (Interleukin-3,IL-3)、人白細胞介素-6 (Interleukin-6,IL-6)、人干細胞 生長因子（Stemcellfactor,SCF)和促血小板生成素（Thrombopoietin，TPO)的造血干細 胞培養(yǎng)基；
[0031] 所述的I型干細胞培養(yǎng)基中，IL-3、IL-6、SCF和TP0的終濃度分別優(yōu)選為20ng/ mL、50ng/mL、50ng/mL和 50ng/mL;
[0032] 所述的造血干細胞培養(yǎng)基優(yōu)選為Stemspan培養(yǎng)基（STEMCELL公司）；
[0033] 步驟（3)中所述的II型干細胞培養(yǎng)基為不含任何白藜蘆醇成分的干細胞培養(yǎng) 基；
[0034] 步驟（3)中所述的II型干細胞培養(yǎng)基優(yōu)選為不含任何白藜蘆醇成分但含有人白 細胞介素 _3 (Interleukin-3,IL-3)、人白細胞介素-6 (Interleukin-6,IL-6)、人干細胞生 長因子（Stemcellfactor,SCF)和促血小板生成素（Thrombopoietin，TP0)的造血干細胞 培養(yǎng)基；
[0035] 所述的II型干細胞培養(yǎng)基中，IL-3、IL-6、SCF和TP0的終濃度分別優(yōu)選為20ng/ mL、50