酶I粉末溶解于l〇〇ml未加任何 因子的培養(yǎng)基中，用之前37°C預(yù)熱)，封口膜封口，劇烈晃動培養(yǎng)瓶5~10秒，置于振動氣浴 鍋中，37°C，70rpm，消化60分鐘，每隔15分鐘劇烈晃動培養(yǎng)瓶5~10秒，直到看起來較為 平滑。
[0020] 5、分離基質(zhì)血管組分（SVF):將消化后的組織用無菌40目濾網(wǎng)分裝到50ml的心管 中，室溫400g離心10分鐘，得到的沉淀即為SVF。
[0021] 6、凈化沉淀：離心后，SVF沉積于離心管底部，用移液管自上而下小心除去上層油 脂和下層的膠原酶溶液。注意：在SVF沉淀上方留下少量的溶液，以免擾動沉淀細(xì)胞。適量 生理鹽水重懸細(xì)胞，吹散，室溫400g，10分鐘離心。離心完畢，小心吸去上清液，不能直接倒 掉。吸取時移液管頭應(yīng)該置于離心管的上部以便于徹底的出去油。l〇ml培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞， 然后將細(xì)胞匯總到50ml離心管中，過100目篩，再次室溫300g，10分鐘離心。
[0022] 7、細(xì)胞種植：離心后加20ml培養(yǎng)基充分混勻?；诮M織塊法：根據(jù)培養(yǎng)瓶的面積 進(jìn)行細(xì)胞種植。按照每平方厘米接種〇. 16ml抽脂得到的脂肪量進(jìn)行接種，即每個T75培養(yǎng) 瓶中接種12ml抽脂脂肪量。即每100ml脂肪組織，最終可以接種8個T75培養(yǎng)瓶。進(jìn)行未 處理脂肪量和最終得到的細(xì)胞懸液換算，進(jìn)而接種細(xì)胞。
[0023] 8、原代細(xì)胞培養(yǎng)：平置培養(yǎng)瓶，將培養(yǎng)瓶放置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱。培養(yǎng)條 件：（37±0.5)°C，二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為（5±0.2)%。培養(yǎng)基：人間充質(zhì)干細(xì)胞無血清完全 培養(yǎng)基（L0NZA，00190632 )。
[0024] 9、換液：原代培養(yǎng)第24h，進(jìn)行全量換液。此后每隔3天全量換液，放置二氧化碳 恒溫恒濕培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。
[0025] 10、原代細(xì)胞收獲：7d左右，原代培養(yǎng)的細(xì)胞克隆團(tuán)的面積百分比到達(dá)70%~80% 時，消化收獲。在培養(yǎng)瓶中加入消化酶(消化酶為〇. 125%Trypsin-EDTA溶液，使用前室溫 (20~25°C)放置15~25min，每75cm2加入2ml消化酶溶液)，消化時間為5~8min，加 入培養(yǎng)基2~3ml反復(fù)吹打瓶底至細(xì)胞大部分脫落，移入50ml離心管中，原培養(yǎng)瓶中加入 4~5ml氯化鈉注射液沖洗瓶壁，加入離心管中定容至50ml，移液管吹打懸浮后，100um無菌 濾網(wǎng)過濾，過濾液收集到50ml離心管中，lOOOrpm，lOmin離心洗滌。
[0026] 11、原代細(xì)胞傳代：觀察單個離心管內(nèi)余下細(xì)胞沉淀量，適當(dāng)合并數(shù)個離心管中細(xì) 胞沉淀至1個離心管中，加入適量培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸浮細(xì)胞，定容至30ml，吹打混勻，取 樣計數(shù)。計數(shù)后l〇〇〇rpm，10min二次離心。去除上清液，在離心管中加入培養(yǎng)基適量，輕輕 吹打重懸浮細(xì)胞，定容后接種至新的培養(yǎng)容器中，傳代細(xì)胞密度為5000~6000個/cm2,即 (3. 75~4. 5)X105個cells/175,按照4. 5X10 5個cells/T75進(jìn)行傳代。在培養(yǎng)容器上 標(biāo)示細(xì)胞代數(shù)與培養(yǎng)時間等信息。將培養(yǎng)容器放置于二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱開始培養(yǎng)， 培養(yǎng)條件：二氧化碳恒溫恒濕培養(yǎng)箱，（37 ± 0. 5 )°C，二氧化碳體積分?jǐn)?shù)為（5 ± 0. 2 ) %。培 養(yǎng)至細(xì)胞融合達(dá)85%~90%。
[0027] 二、脂肪MSC鑒定 1、取P3代脂肪MSC，流式檢測細(xì)胞表面標(biāo)記，結(jié)果見表1。
[0028] 表1流式細(xì)胞儀檢測P3代脂肪MSC表面標(biāo)記物
其中，陽性標(biāo)記物⑶29、⑶73、⑶90、⑶49d表達(dá)大于95%，陰性標(biāo)記物⑶14、⑶34、⑶45、HLA-DR表達(dá)低于2%，證明該細(xì)胞為脂肪MSC。
[0029] 三、誘導(dǎo)脂肪MSC分化為神經(jīng)細(xì)胞：傳3代的MSC，0. 125%Trypsin_EDTA溶液消化 收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)活細(xì)胞密度，并調(diào)整密度1X104/cm2,接種于事先 放置有經(jīng)多聚賴氨酸處理的消毒蓋玻片的24孔板內(nèi)，制備細(xì)胞爬片。待細(xì)胞接近80%融合， 生長旺盛時再進(jìn)行誘導(dǎo)分化，分組如表2。
[0030] 表2誘導(dǎo)脂肪MSC分化為神經(jīng)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)分組
四、誘導(dǎo)后神經(jīng)細(xì)胞鑒定 1、形態(tài)學(xué)觀察：倒置顯微鏡下，動態(tài)觀察脂肪MSC誘導(dǎo)前后形態(tài)學(xué)變化。
[0031] 2、免疫細(xì)胞化學(xué)染色法（SABC法）檢測： (1) 收集誘導(dǎo)后細(xì)胞爬片，〇. 01MPBS(PH=7. 2)沖洗，5minX3次，冷丙酮固定lOmin， PBS沖洗 5minX3 次； (2) 3%H202溶液孵育30min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，0. 01MPBS沖洗，5minX3 次； (3) 滴加封閉用羊血清(試劑A)，37°C孵育30min，吸除多余血清，不洗； (4) 分別滴加小鼠抗NeuN、兔抗-TubulinIII-抗、小鼠抗GFAP，4°C冰箱過夜，PBS沖 洗，5minX3 次； (5) 滴加生物素標(biāo)記的相應(yīng)的抗小鼠或抗兔二抗(試劑B)，37°C孵育lh，0. 01MPBS沖 洗，5minX3 次； (6) 滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素(試劑C)，37°C孵育30min，0. 01MPBS沖 洗，5minX3 次； (7) DAB顯色：取蒸餾水lml，加入試劑盒中A、B、C成分各一滴，混勻后，滴加至上述處 理的細(xì)胞標(biāo)本上；室溫下顯色，鏡下控制反應(yīng)時間。至顯色滿意時(一般2~10min)加蒸 餾水終止反應(yīng)； (8) 常規(guī)脫水透明封片：50%酒精lmin，70%酒精lmin，80%酒精lmin，95%酒精lmin， 100%酒精I(xiàn)5min，100%酒精I(xiàn)I5min，二甲苯I5min，二甲苯II5min，中性樹膠封片。
[0032] 對照實(shí)驗(yàn)：以0. 01MPBS代替第一抗體，其余步驟相同。
[0033] 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測誘導(dǎo)前后NeuN、0-TubulinIII、GFAP的表達(dá)情況，隨機(jī)抽取4 張玻片，200倍視野下隨機(jī)選取5個視野，分別計算陽性細(xì)胞的比例。陽性細(xì)胞占總細(xì)胞比 例以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（王±4表示。采用SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以 表示，多組比較采用方差分析，兩組間率的比較采用x2檢驗(yàn)，P〈〇. 05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0034] 3、免疫熒光染色法檢測 免疫熒光染色步驟同上，一抗為兔抗0 -TubulinIII，熒光二抗為Cy3-羊抗兔IgG，陰性 對照用PBS代替第一抗體。
[0035] 免疫熒光染色法檢測誘導(dǎo)前后三組P-TubulinIII的表達(dá)情況，并隨機(jī)抽取4張玻 片，每張玻片200倍視野下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)陽性細(xì)胞總數(shù)和Hoechst復(fù)染的細(xì)胞 總數(shù)，計算0-TubulinIII陽性細(xì)胞的比例。陽性細(xì)胞占總細(xì)胞比例以（舞?。?)表示。采用 SPSS11. 0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（)表示，多組比較采用方差分析，兩組間率 的比較采用x2檢驗(yàn)，P〈〇. 05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0036] 五、結(jié)果 1、形態(tài)學(xué)觀察 化學(xué)誘導(dǎo)組：傳代后脂肪MSC貼壁快，細(xì)胞增殖旺盛，細(xì)胞呈均一的成纖維細(xì)胞樣形 態(tài)，如圖1所示。預(yù)誘導(dǎo)12h后，原來梭形的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞胞體發(fā)生收縮，細(xì)胞邊緣變 得不規(guī)整，有許多細(xì)的突起。預(yù)誘導(dǎo)結(jié)束時，一部分細(xì)胞胞體呈圓形。正式誘導(dǎo)后，細(xì)胞胞 體進(jìn)一步收縮，呈圓形、三角形，可見多個突起，而且發(fā)出分支，形成圓錐狀終末端；有的突 起逐漸伸長。5h后細(xì)胞形態(tài)不再發(fā)生明顯變化，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)典型的神經(jīng)元樣形態(tài)。誘 導(dǎo)后，細(xì)胞部分死亡、脫落。繼續(xù)培養(yǎng)5d后大部分細(xì)胞漂浮死亡。
[0037] 生長因子組：誘導(dǎo)分化培養(yǎng)后，3d內(nèi)脂肪MSC基本無變化。5~10d部分細(xì)胞胞體 逐漸增大，胞突變細(xì)伸長。2周左右，部分細(xì)胞胞體呈圓形，較大，胞體伸出一個、兩個或多個 突起，突起較長，折光性好，局部區(qū)域相鄰細(xì)胞突起連成網(wǎng)狀，約一半的細(xì)胞呈現(xiàn)典型的神 經(jīng)細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞存活良好，繼續(xù)培養(yǎng)2周未見到明顯的細(xì)胞漂浮、脫落現(xiàn)象。
[0038] 本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基組：本發(fā)明誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)1~2d后細(xì)胞形態(tài)變化明顯，細(xì) 胞胞漿、細(xì)胞質(zhì)以細(xì)胞核為中心收縮，細(xì)胞變短，體積變小，細(xì)胞形成雙極或多極的細(xì)胞體， 部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)收縮形成細(xì)胞突起，細(xì)胞形態(tài)呈小橢圓形、星型、蝌蚪型、細(xì)長條狀等，細(xì) 胞反光增強(qiáng)。3~5d誘導(dǎo)，細(xì)胞突起進(jìn)一步延長和變細(xì)，部分細(xì)胞伸出多根突起，折光性好， 局部區(qū)域相鄰細(xì)胞突起連成網(wǎng)狀，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)典型的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)，如圖2所示。7d 后，細(xì)胞狀態(tài)好，存活時間長，未見到明顯的細(xì)胞漂浮、脫落現(xiàn)象。
[0039] 2、免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，NeuN陽性細(xì)胞胞核著色，胞漿著色淺，如圖3所示。誘導(dǎo) 前三組NeuN均為陰性表達(dá)，化學(xué)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)后NeuN陽性細(xì)胞率為（72. 3±2. 1) % ;生長因 子誘導(dǎo)后NeuN陽性細(xì)胞率為（39. 6±2. 8)% ;本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)后NeuN陽性細(xì)胞率 為（86. 6±4. 5)%。本發(fā)明的誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化率高于化學(xué)誘導(dǎo)劑和生長因子（P〈0. 05)， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0040] 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示，P-TubulinIII陽性細(xì)胞胞漿著色，呈棕黃色顆