[0044]將廢棄海綿切割成2X2X2mm小塊，95%乙醇浸泡過(guò)夜，反復(fù)洗滌，干燥至恒重；將預(yù)處理好的海綿按20mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亞胺水溶液(終濃度為1.0mg/ml)處理6h，然后用去離子水洗滌3次，收集聚乙烯亞胺涂敷好的海綿，自然干燥過(guò)夜；加入芽胞懸液于水中，使終濃度為5mg/ml (濕重)，添加戊二醛交聯(lián)劑(體積濃度為0.4% )，并在37°C固定24h ;過(guò)濾，用緩沖液沖洗3次，分別收集上清液和固定化芽胞，測(cè)得酶活為1.50U/g°
[0045]實(shí)施例4固定化方法3
[0046]將廢棄海綿切割成2X2X2mm小塊，95%乙醇浸泡過(guò)夜，反復(fù)洗滌，干燥至恒重；將預(yù)處理好的海綿按20mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亞胺水溶液(終濃度為2.0mg/ml)處理6h，然后用去離子水洗滌3次，收集聚乙烯亞胺涂敷好的海綿，自然干燥過(guò)夜；加入芽胞懸液于水中，使終濃度為5mg/ml (濕重)，添加戊二醛交聯(lián)劑(體積濃度為0.4% )，并在37°C固定24h ;過(guò)濾，用緩沖液沖洗3次，分別收集上清液和固定化芽胞，測(cè)得酶活為0.76U/g°
[0047]實(shí)施例5固定化方法4
[0048]將廢棄海綿切割成2X2X2mm小塊，95%乙醇浸泡過(guò)夜，反復(fù)洗滌，干燥至恒重；將預(yù)處理好的海綿按30mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亞胺水溶液(終濃度為1.0mg/ml)處理6h，然后用去離子水洗滌3次，收集聚乙烯亞胺涂敷好的海綿，自然干燥過(guò)夜；加入芽胞懸液使終濃度為5mg/ml (濕重)，添加戊二醛交聯(lián)劑(體積濃度為0.4% )，并在37°C，pH5.0的條件下固定24h ;過(guò)濾，用緩沖液沖洗3次，分別收集上清液和固定化芽胞，測(cè)得酶活為 1.13U/go
[0049]實(shí)施例6固定化方法5
[0050]將廢棄海綿切割成2X2X2mm小塊，95%乙醇浸泡過(guò)夜，反復(fù)洗滌，干燥至恒重；將預(yù)處理好的海綿按30mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亞胺水溶液(終濃度為1.0mg/ml)處理6h，然后用去離子水洗滌3次，收集聚乙烯亞胺涂敷好的海綿，自然干燥過(guò)夜；加入芽胞懸液使終濃度為5mg/ml (濕重)，添加戊二醛交聯(lián)劑(體積濃度為0.4% )，并在37°C，pH
7.5的條件下固定24h ;過(guò)濾，用緩沖液沖洗3次，分別收集上清液和固定化芽胞，測(cè)得酶活為 2.06U/go
[0051 ] 實(shí)施例7固定化方法6
[0052]將廢棄海綿切割成2X2X2mm小塊，95%乙醇浸泡過(guò)夜，反復(fù)洗滌，干燥至恒重；將預(yù)處理好的海綿按30mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亞胺水溶液(終濃度為1.0mg/ml)處理6h，然后用去離子水洗滌3次，收集聚乙烯亞胺涂敷好的海綿，自然干燥過(guò)夜；加入芽胞懸液使終濃度為5mg/ml (濕重)，添加戊二醛交聯(lián)劑(體積濃度為0.4% )，并在37°C，pH9.0的條件下固定24h ;過(guò)濾，用緩沖液沖洗3次，分別收集上清液和固定化芽胞，測(cè)得酶活為 1.23U/go
[0053]實(shí)施例8固定化方法7
[0054]將廢棄海綿切割成2 X 2 X 2mm小塊，并按40mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亞胺水溶液(終濃度為1.0mg/ml)處理12h，然后用去離子水洗滌3次，收集聚乙烯亞胺涂敷好的海綿，自然干燥過(guò)夜；加入芽胞懸液使終濃度為3mg/ml (濕重)，添加戊二醛交聯(lián)劑(體積濃度為2% )，并在37°C，pH 7.5的條件下固定12h ;過(guò)濾，用緩沖液沖洗3次，分別收集上清液和固定化芽胞，測(cè)得酶活為1.08U/go
[0055]實(shí)施例9固定化方法8
[0056]將廢棄海綿切割成2X2X2mm小塊，并按40mg/ml浸于水中，加入聚乙烯亞胺水溶液(終濃度為1.0mg/ml)處理12h，然后用去離子水洗滌3次，收集聚乙烯亞胺涂敷好的海綿，自然干燥過(guò)夜；加入碳二亞胺鹽酸鹽使其終濃度為0.4mg/ml，并使用超聲波振蕩1min,使其充分分散；加入芽胞懸液使終濃度為5mg/ml (濕重)，再使用超聲波處理30min，并在37°C，pH 7.0緩沖液，200r/min條件下固定24h ;過(guò)濾，用緩沖液沖洗3次，分別收集上清液和固定化芽胞，測(cè)得酶活為2.57U/go
[0057]實(shí)施例10固定化芽胞漆酶的操作穩(wěn)定性
[0058]稱取由實(shí)施例8制備得到的干重固定化芽胞漆酶0.05g置于4ml反應(yīng)體系中，以丁香醛連氮為底物檢測(cè)其酶活，每次反應(yīng)完畢后，在旋轉(zhuǎn)振蕩器上振蕩5min，洗滌3次，重新加入反應(yīng)體系檢測(cè)酶活。重復(fù)使用7次仍達(dá)最初活力的86.09%。
[0059]實(shí)施例11固定化芽胞漆酶應(yīng)用于染料脫色
[0060]稱取由實(shí)施例5制備得到的干重固定化芽胞漆酶0.1g投入試管中，依次加入介體2，2’ -聯(lián)氮基-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(0.1mM)，染料(終濃度分別為100mmg/ml (甲基綠)和50mmg/ml (甲基紅和酸性紅I)，最后加入0.1M梓檬酸磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)使其最終反應(yīng)體系為4ml。將混合反應(yīng)液放入搖床，在200r/min，37°C條件下脫色24h0最終染料脫色率分別為87.13%,55.43%和75.89%。
[0061]雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種固定化芽胞漆酶，其特征在于，以廢棄海綿為載體，通過(guò)共價(jià)結(jié)合作用將芽胞漆酶固定在海綿纖維表面。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化芽胞漆酶，其特征在于，所述廢棄海綿為聚乙烯醇海綿。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化芽胞漆酶，其特征在于，所述芽胞漆酶是指芽胞桿菌屬菌株所產(chǎn)的具漆酶活性的芽胞。4.一種制備權(quán)利要求1 一 3任一所述固定化芽胞漆酶的方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備芽胞桿菌屬菌株所產(chǎn)的芽胞； (2)海綿的預(yù)處理:將廢棄海綿切割成2X2X2mm小塊，95%乙醇浸泡過(guò)夜，反復(fù)洗滌，干燥至恒重； (3)聚乙烯亞胺涂敷與芽胞固定化:將預(yù)處理好的海綿按10- 50mg/ml浸于水中，用聚乙烯亞胺水溶液(0.1 - 2.0mg/ml)處理時(shí)間3 — 12h，然后用去離子水洗滌3次，收集聚乙烯亞胺涂敷好的海綿，自然干燥過(guò)夜； (4)加入芽胞懸液使終濃度為1.0 — 10.0mg/ml (濕重)，添加戊二醛交聯(lián)劑(體積濃度為 0.4 — 4% )，并在 4 - 40°C, pH 5.0 - 9.0 緩沖液，50 — 250r/min 條件下固定 8 —24h ； (5)回收:芽胞與聚乙烯亞胺接枝的海綿經(jīng)混合固定化處理后，過(guò)濾，用緩沖液沖洗1- 5次，分別收集上清液和固定化芽胞，保藏于O — 40°C。5.權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)也可以不經(jīng)乙醇浸泡。6.權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述聚乙烯亞胺水溶液終濃度為lmg/ml，處理時(shí)間為6h。7.權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)聚乙烯亞胺涂敷的海綿、芽胞以及戊二醛的含量分別為30mg/ml，5mg/ml (濕重)以及2% (體積濃度)。8.權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)加入交聯(lián)劑后，在37°C，0.1M檸檬酸磷酸鹽緩沖液(pH 7.5)，200r/min條件下固定12h。9.權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)加入的交聯(lián)劑也可以是碳二亞胺鹽酸鹽，其處理方法為，加入碳二亞胺鹽酸鹽使其終濃度為0.2 — 2.0mg/ml，并使用超聲波振蕩5 - 30min，使其充分散；加入芽胞懸液使終濃度為1.0 — 10.0mg/ml (濕重)，再使用超聲波處理10 - 60min，并在4 一 40°C,pH 5.0 - 9.0緩沖液，50 — 250r/min條件下固定8 一 24h010.權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，碳二亞胺鹽酸鹽的終濃度為0.4mg/ml，前后兩次超聲波處理的時(shí)間分別為1min和30min。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種固定化芽胞漆酶及其制備方法，屬于固定化技術(shù)領(lǐng)域。其以廢棄海綿為載體，使用聚乙烯亞胺接枝，再通過(guò)雙功能交聯(lián)劑將芽胞共價(jià)結(jié)合到海綿上。本發(fā)明提供的固定化芽胞漆酶易于分離，可重復(fù)使用多次；該方法制備過(guò)程簡(jiǎn)單，原料價(jià)格低廉，易于生產(chǎn)，而且可以有效解決廢棄海綿的回收再利用的問(wèn)題。此外，本發(fā)明所提供的固定化芽胞漆酶可反復(fù)應(yīng)用于染料脫色，并保持較高的脫色能力。
【IPC分類】C12N9/02, C12N11/14
【公開(kāi)號(hào)】CN105062982
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510456440
【發(fā)明人】管政兵, 周穩(wěn), 廖祥儒, 蔡宇杰, 袁冬
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年7月29日