一類熱穩(wěn)定性提高的淀粉酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一類熱穩(wěn)定性提高的淀粉酶突變體及其編碼 基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] a-淀粉酶（EC3. 2. 1. 1)可水解高分子淀粉為低分子寡糖，在生物能源、飼料、食 品等工業(yè)具有廣泛的應(yīng)用價值。天然淀粉的酶法利用工藝的第一步往往是在高溫下將淀粉 糊化，在此過程中添加a-淀粉酶，因而市場對耐高溫的a-淀粉酶需求旺盛。然而從自然 環(huán)境中篩選獲得的野生型淀粉酶往往不能完全適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用過程中苛刻的外部環(huán)境。發(fā) 明人從深海熱泉耐熱細菌Bacillussp.SCSIO15121中克隆到一條新的a-淀粉酶基因 amyl21 (KJ577547)，重組酶AMY121最適作用溫度為75°C，但在不添加鈣離子時75°C半衰期 僅為7min，有必要提尚其熱穩(wěn)定性。
[0003] 蛋白質(zhì)工程技術(shù)（包括定向進化、理性設(shè)計、半理性設(shè)計）可改變生物催化劑的穩(wěn) 定性、對映體選擇性及底物特異性，使突變酶更能適應(yīng)應(yīng)用需求。半理性設(shè)計參考結(jié)構(gòu)信 息，確定幾個潛在熱點氨基酸殘基構(gòu)建小而有效的突變體庫，從中篩選到目標突變體。半理 性設(shè)計結(jié)合了理性設(shè)計和定向進化的優(yōu)勢，在蛋白質(zhì)工程改造方面應(yīng)用廣泛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中a-淀粉酶AMY121熱穩(wěn)定性差的不足，提供了一類熱穩(wěn)定 性提高的淀粉酶突變體及其編碼基因和應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的淀粉酶突變體，其特征在于，其為淀粉酶突變體Y187E、K205L或Y187E/ K205L；
[0006] 所述的淀粉酶突變體Y187E，其氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示；
[0007] 所述的淀粉酶突變體K205L，其氨基酸序列如SEQIDNO. 3所示；
[0008] 所述的淀粉酶突變體Y187E/K205L，其氨基酸序列如SEQIDNO. 4所示。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是提供上述淀粉酶突變體的編碼基因。
[0010] 所述的編碼基因，當(dāng)為淀粉酶突變體Y187E時，其編碼基因的核苷酸序列如SEQID NO. 5所示。
[0011] 所述的編碼基因，當(dāng)為淀粉酶突變體K205L時，其編碼基因的核苷酸序列如SEQID NO. 6所示。
[0012] 所述的編碼基因，當(dāng)為淀粉酶突變體Y187E/K205L時，其編碼基因的核苷酸序列 如SEQIDN0. 7 所示。
[0013] 含有上述淀粉酶突變體的編碼基因的表達載體。
[0014] 含有上述表達載體的重組菌。
[0015] 本發(fā)明的第三個目的是提供上述淀粉酶突變體在水解淀粉中的應(yīng)用。尤其是在高 溫條件下水解淀粉中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明由深海熱泉細菌Bacillussp.SCSIO15121a-淀粉酶amy121基因出發(fā)， 鑒定了一個與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸殘基，以其為中心，對周邊殘基的編碼基因進行半理 性設(shè)計而引入突變，將突變的基因序列連接表達載體轉(zhuǎn)化表達宿主菌，發(fā)酵培養(yǎng)并對表達 的淀粉酶突變體進行提取、篩選，從而得到熱穩(wěn)定性提高的淀粉酶突變體。
[0017] 本發(fā)明制備得到的淀粉酶突變體Y187E、K205L和Y187E/K205L與野生型淀粉酶 八1^121相比，最適作用溫度〇'__)、75°(：下的半衰期匕/批75°(：)、半失活溫度〇' 5。15)都 獲得提高，具有更優(yōu)良的熱穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性提高的淀粉酶突變體擴展了深海熱泉細菌淀 粉酶AMY121的應(yīng)用范圍，使其可應(yīng)用于生物能源、食品、日化添加劑、飼料工業(yè)生產(chǎn)和生活 垃圾處理等領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0018] 圖1為溫度對Lys209殘基替換淀粉酶突變體活性的影響。
[0019]圖2為Lys209殘基替換淀粉酶突變體T5。15值的測定結(jié)果。
[0020] 圖3為淀粉酶突變體Y187E、K205L和Y187E/K205L的最適作用溫度。
[0021] 圖4為淀粉酶突變體Y187E、K205L和Y187E/K205L的T5。15值的測定結(jié)果。
【具體實施方式】
[0022] 以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。
[0023] 下述實施例中所用的方法，如無特殊說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見： ((MolecularCloning:ALaboratoryManual〉〉（Sambrook,J.RussellDsvidff.,Molecular Cloning:ALaboratoryManual, 3rdedition, 2001，NY,ColdSpringHarbor)。所用引物均 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0024] 實施例1
[0025] 在深海熱泉耐熱細菌Bacillussp.SCSI0 15121中a-淀粉酶AMY121的第208 位和第209位氨基酸殘基之間插入兩個氨基酸后，其熱穩(wěn)定性顯著下降。通過同源建模發(fā) 現(xiàn)兩個氨基酸的插入使Lys209的構(gòu)象發(fā)生明顯變化。所述的a-淀粉酶AMY121的氨基 酸序列如SEQIDNO. 1所示，其編碼基因一a-淀粉酶基因amy121的核苷酸序列已經(jīng)存入 Genbank中，其登錄號為KJ577547。
[0026] 1與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸殘基Lys209的鑒定
[0027] 1. 1反向PCR介導(dǎo)的a-淀粉酶AMY121的第209位Lys定點突變
[0028] 為了進一步研究與a-淀粉酶AMY121熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸殘基Lys209,由深海 熱泉細菌Bacillussp.SCSIO15121a-淀粉酶amyl21基因（KJ577547)出發(fā)，設(shè)計a-淀 粉酶AMY121的209位Lys定點飽和突變的引物，利用反向PCR介導(dǎo)定點突變，其引物設(shè)計 如下：
[0029]K209W-F 5' -TATAAGTTTCAAGGATGGGCATGGGATTGGGAA-3，，
[0030]K209P-F 5' -TATAAGTTTCAAGGACCGGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0031] K209I-F5' -TATAAGTTTCAAGGAATTGCATGGGATTGGGAA-3r ,
[0032]K209V-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAGTGGCATGGGATTGGGAA-3，，
[0033]K209F-F5' -TATAAGTTTCAAGGATTTGCATGGGATTGGGAA-3r ,
[0034]K209L-F 5' -TATAAGTTTCAAGGACTGGCATGGGATTGGGAA-3，，
[0035]K209E-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAGAAGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0036]K209S-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAAGCGCATGGGATTGGGAA-3，，
[0037]K209M-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAATGGCATGGGATTGGGAA-3，，
[0038]K209Y-F 5' -TATAAGTTTCAAGGATATGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0039]K209N-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAAATGCATGGGATTGGGAA-3，，
[0040]K209D-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAGATGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0041]K209Q-F 5' -TATAAGTTTCAAGGACAGGCATGGGATTGGGAA-3，，
[0042]K209G-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAGGCGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0043]K209H-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAGATGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0044]K209A-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAGCGGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0045] K209R-F 5' -TATAAGTTTCAAGGACGTGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0046]K209T-F 5' -TATAAGTTTCAAGGAACCGCATGGGATTGGGAA-3'，
[0047]K209C-F 5' -TATAAGTTTCAAGGACGCGCATGGGATTGGGAA-3';
[0048] 以上為正向引物。209位的Lys定點飽和突變的反向引物可以共用，引物如下：
[0049]K209-allR5' -TCCTTGAAACTTATAGATGCGGTTCAGCT-3'。
[0050] 以實驗室前期構(gòu)建的淀粉酶AMY121表達載體pET28a_amyl21(將a-淀粉酶 amyl21基因插入表達載體pET28a的酶切位點Ncol和Xhol之間）為模板，利用上述正反 向引物進行反向PCR反應(yīng)，PCR擴增使用的DNA聚合酶為北京全式金生物技術(shù)有限公司的 FastPfumix;反應(yīng)程序為：95°C5min;95°C30sec，55°C30sec，72°C3min，共 30 個循環(huán)； 72°C10min。反應(yīng)結(jié)束后，用DpnI消化甲基化模板，純化PCR產(chǎn)物后與大腸桿菌表達載 pET28a連接，然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌XLl-Blue中，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于50yg/ml卡 那霉素的LB抗性平板上，37°C培養(yǎng)12小時。用滅菌PBS緩沖液將不少于1000個克隆的轉(zhuǎn) 化子重懸并收集菌體，提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Rosetta(DE3)，于50yg/ml卡那霉素的 LB抗性平板上，37°C培養(yǎng)12小時，平板上生長的菌落即為a-淀粉酶AMY121的Lys209殘 基替換的突變酶轉(zhuǎn)化子。1. 2a-淀粉酶AMY121的Lys209殘基替換突變酶的純化和分析
[0051] 1. 2. 1突變酶的分離純化
[0052] 將上述突變