酸鈉和膨潤土的混合溶液的體積比）為組分，以 固定化微球?qū)BP的降解率為考察目標，優(yōu)化固定化成球條件。固定化微球正交設(shè)計如表 1所示。正交實驗的結(jié)果表明固定化成球的最佳條件為海藻酸鈉/膨潤土為質(zhì)量比2:1，殼 聚糖濃度為〇. 5%，氯化鈣濃度為1. 5%，包菌量為10%。其固定化微球正交設(shè)計結(jié)果如表 2所示。
[0043] 表1?固定化微球正交設(shè)計表
[0044]
[0045] 表2?固定化微球正交設(shè)計結(jié)果
[0046]
[0047] 從表2可以看出四種因素對固定化微球的包埋率有明顯的影響。比較極差R大小 可知影響固定化微球降解率的組分依次為海藻酸鈉與膨潤土的質(zhì)量比例（A)>包菌量（D)> 殼聚糖濃度（B)>氯化鈣濃度（C)。由正交表實驗所顯示的最佳組合為A2B2C3D1<3
[0048] 根據(jù)正交試驗的結(jié)果得出優(yōu)化材料的最優(yōu)配比及其制備工藝（以120ml反應(yīng)體系 制備本發(fā)明的固定化微球）如下：
[0049] (1)溶液的配制
[0050] 殼聚糖溶液：將0. 2g殼聚糖和250yL乙酸溶于40ml蒸餾水中，靜置4h，然后用 lmol〃LWaOH調(diào)節(jié)pH至5. 5,最終配制成質(zhì)量分數(shù)為0. 5%的殼聚糖溶液；
[0051 ] 海藻酸鈉和膨潤土的混合溶液：分別將1. 33g海藻酸鈉和0. 67g膨潤土溶于40ml 蒸餾水中，攪拌均勻，海藻酸鈉與膨潤土的質(zhì)量分數(shù)分別為3. 3%和1. 7% ;
[0052] 氯化鈣溶液：將0.60g氯化鈣溶于40ml蒸餾水中，制備成質(zhì)量分數(shù)為1. 5%的氯 化鈣溶液。
[0053] (2)鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球制備
[0054] ①將培養(yǎng)24h的鄰苯二甲酸二丁酯降解菌培養(yǎng)液裝入無菌離心管中，離心并去上 清，留下菌體，用與無菌生理鹽水沖洗菌體并搖勻，制成細菌懸液，使細菌懸液的〇D_= 2 ;
[0055] ②將步驟①的細菌懸液按照體積比為1:10~1:20的比例加入到海藻酸鈉和膨潤 土的混合溶液，混勻；
[0056] ③用注射器吸取適量步驟②混勻后的混合液，懸空逐滴勻速滴入到氯化鈣溶液 中，固化30min，固定成球后將其轉(zhuǎn)入殼聚糖溶液中覆膜30min，之后將小球用無菌水清洗 三次，即得到硬化的鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球。
[0057] 固定化鄰苯二甲酸二丁酯降解菌成球效果較好，形態(tài)規(guī)則，易于成球。鄰苯二甲酸 二丁酯降解菌的固定化微球的照片如圖1所示。
[0058] 試驗例1本發(fā)明制備的固定化微球的物理性能和應(yīng)用
[0059] (一）固定化微球的紅外光譜分析
[0060] 鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球中加入的膨潤土的表面存在大量的-OH， 與海藻酸鈣的羧基發(fā)生了離子化，二者形成離子鍵，產(chǎn)生了微弱的靜電引力。而膨潤土含有 大量的羥基，在水介質(zhì)中能與海藻酸鈉形成氫鍵作用，可有效抑制海藻酸鈉的大量溶脹。鄰 苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球的紅外光譜如圖2所示。
[0061] (二）固定化微球的掃描電鏡分析
[0062] 該固定化鄰苯二甲酸二丁酯降解菌成球有大量的微孔存在，有利于固定化鄰苯二 甲酸二丁酯降解菌有效的獲取營養(yǎng)物質(zhì)和溶解氧，并有效的阻止了大分子有毒有害物質(zhì)對 包埋在載體內(nèi)的鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的毒害，能及時的排出代謝產(chǎn)物和有毒物質(zhì)，這 種結(jié)構(gòu)對維持固定化鄰苯二甲酸二丁酯降解菌良好的內(nèi)部環(huán)境起到了決定性的作用，是保 證固定化鄰苯二甲酸二丁酯降解菌較高降解率的重要因素。鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的固 定化微球的掃描電鏡分析如圖3所示。
[0063](三）固定化微球的比表面積以及孔徑分析
[0064] BET分析結(jié)果表明，孔徑主要分布在3. 88nm左右，部分分布在12. 26nm左右，平均 孔徑為7. 5nm，該鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球的比表面積為59. 369m2/g。鄰苯 二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球的比表面積以及孔徑分析如圖4所示。
[0065] (四）固定化微球的土壤修復(fù)效果
[0066] 在28天的修復(fù)過程中對土壤中DBP去除效果表明，14d時，各處理組DBP殘留量均 在66%以上，其中空白對照組高達90. 93% ;在28d時固定化微球處理組中，DBP的殘留量 小于20% ;相比之下空白對照組DBP殘留量最高為70. 76%，游離菌處理組介于兩者之間， DBP殘留量在50%以上（圖5)。
【主權(quán)項】
1. 一種鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球，包括固定化材料和鄰苯二甲酸二丁酯 降解菌懸液，其特征在于，所述固定化材料由以下按重量份計的組分制備而成： 海藻酸鈉1. 00-1. 33份，膨潤土 0. 67-1. 50份，殼聚糖0. 10-0. 30份，氯化鈣0. 20-0. 60 份； 其中，海藻酸鈉和膨潤土的混合溶液是由以下方法制備得到： 將所述重量份的海藻酸鈉和膨潤土溶于蒸餾水中，攪拌均勻，即得海藻酸鈉與膨潤土 的質(zhì)量分數(shù)分別為2. 5%~3. 3%和1. 7%~3. 8%的混合溶液； 所述的鄰苯二甲酸二丁酯降解菌懸液與所述的海藻酸鈉和膨潤土的混合溶液的體積 比為1:10~1:20。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定化微球，其特征在于，所述固定化材料由以下按重量份 計的組分制備而成： 海藻酸鈉1. 33份，膨潤土 0. 67份，殼聚糖0. 20份，氯化鈣0. 60份； 其中，所述的海藻酸鈉和膨潤土的混合溶液中海藻酸鈉與膨潤土的質(zhì)量分數(shù)分別為 3. 3%和1. 7% ;所述的鄰苯二甲酸二丁酯降解菌懸液與所述的海藻酸鈉和膨潤土的混合溶 液的體積比為1:10。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的固定化微球，其特征在于，所述的鄰苯二甲酸二 丁酯降解菌為假單胞菌屬（Pseudomonas sp. ) DNB-Sl，已被專利公開，專利申請?zhí)枮?201410798113.0,專利名稱為鄰苯二甲酸二丁酯降解菌；所述的鄰苯二甲酸二丁酯降解菌 懸液的〇D6QCI=2。4. 制備權(quán)利要求1所述的固定化微球的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 溶液的配制 殼聚糖溶液：將殼聚糖和乙酸按質(zhì)量體積比2:5~6:5的比例溶于蒸餾水中，靜置4h， 然后用Imol *L 1NaOH調(diào)節(jié)pH至5. 5,最終配制成質(zhì)量分數(shù)為0. 25~0. 75%的殼聚糖溶液； 氯化鈣溶液：將氯化鈣溶于蒸餾水中，制備成質(zhì)量分數(shù)為為0. 5%~1. 5%的氯化鈣溶 液； (2) 鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球制備 ① 將培養(yǎng)24h的鄰苯二甲酸二丁酯降解菌培養(yǎng)液裝入無菌離心管中，離心并去上清， 留下菌體，用與無菌生理鹽水沖洗菌體并搖勻，制成細菌懸液，使細菌懸液的〇D_=2 ; ② 將步驟①的細菌懸液按照體積比為1:10~1:20的比例加入到海藻酸鈉和膨潤土的 混合溶液，混勻； ③ 用注射器吸取適量步驟②混勻后的混合液，懸空逐滴勻速滴入到氯化鈣溶液中，固 化30min，固定成球后將其轉(zhuǎn)入殼聚糖溶液中覆膜30min，之后將小球用無菌水清洗三次， 即得到硬化的鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的海藻酸鈉和膨潤土的混合溶液中 海藻酸鈉與膨潤土的質(zhì)量分數(shù)分別為3. 3%和1. 7% ;所述的殼聚糖溶液中殼聚糖的質(zhì)量分 數(shù)為〇. 5% ;所述的氯化鈣溶液中氯化鈣的質(zhì)量分數(shù)為1. 5% ;所述的鄰苯二甲酸二丁酯降解 菌懸液與所述的海藻酸鈉和膨潤土的混合溶液的體積比為1:10。6. 權(quán)利要求1-3任一項所述的固定化微球在生物降解鄰苯二甲酸二丁酯中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球及其制備方法和應(yīng)用，屬于生化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以海藻酸鈉、膨潤土、殼聚糖和氯化鈣為固定化材料，對鄰苯二甲酸二丁酯降解菌進行固定，從而得到鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的固定化微球?？疾旃潭ɑ⑶蛟?8天的修復(fù)過程中對土壤中DBP去除效果，在28d時固定化微球處理組中，DBP的殘留量小于20％；相比之下空白對照組DBP殘留量最高為70.76％，游離菌處理組介于兩者之間，DBP殘留量在50％以上。本發(fā)明鄰苯二甲酸二丁酯降解菌的固定，避免了土著微生物的競爭以及不利于微生物生存的土壤條件的侵害，為有效解決DBP污染土壤提供理論基礎(chǔ)以及技術(shù)支持。
【IPC分類】C12N11/14, B09C1/10, C12N11/10, C12R1/38, C12N11/04
【公開號】CN105063006
【申請?zhí)枴緾N201510418972
【發(fā)明人】張穎, 孫國強, 王蕾, 陳威, 馮程程, 陶月, 姜昭, 王鵬杰, 張惠
【申請人】東北農(nóng)業(yè)大學(xué), 黑龍江省環(huán)境監(jiān)測中心站
【公開日】2015年11月18日
【申請日】2015年7月16日