濃度為0.25mg/ml的 步驟3)中得到的甘油脫氫酶-輔酶氧化酶融合酶的Tris-HCl(0.lM，pH7. 0)酶溶液以1:1 的比例加入至步驟4)中得到的聚乙烯亞胺-金屬溶液，同時(shí)不斷攪拌孵化，形成固定化顆 粒，離心分離，并用去離子水沖洗，重懸于Tris-HCl(0.05M，pH7.0)緩沖液中，形成聚乙烯 亞胺金屬配位固定化甘油脫氫酶-輔酶氧化酶融合酶多酶耦聯(lián)體系，甘油脫氫酶-輔酶氧 化酶融合酶的包埋率為97. 6%，甘油脫氫酶酶活為12. 8U/mg，輔酶氧化酶酶活為1. 7U/mg， 其SEM形態(tài)見圖5。
[0053] 6)利用催化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮檢測(cè)酶活性的方法：
[0054] 原理：二羥基丙酮有還原性，在煮沸條件下，可以與磷鉬酸試劑發(fā)生反應(yīng)，生成鉬 藍(lán)，使溶液呈藍(lán)色，其顏色深度與二羥丙酮的濃度成正比，可以用比色法時(shí)行定量測(cè)定。
[0055] 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別吸取各標(biāo)準(zhǔn)濃度二羥丙酮（0. 05、0. 1、0. 15、0. 2、0. 25、 0. 4mg/mL) 100yL于1. 5mL離心管，然后分別加入100yL磷鉬酸試劑，置于100°C水浴箱加 熱15min。取20yL顯色液加入200yL去離子水中，在630nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為 縱坐標(biāo)，二羥丙酮濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性回歸方程為：y= 9. 5429X+0. 0454,R2 =0? 9989(圖 9)。
[0056] 底物甘油的濃度用高效液相色譜檢測(cè)，色譜條件為：AmineX-HPX-87H色譜柱 (Bio-rad)，流動(dòng)相為5mmol/L的硫酸溶液（用娃哈哈純凈水配制），流動(dòng)相流速為0. 5mL/ min，柱溫65°C，示差折光檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度45°C，進(jìn)樣量20yL，色譜圖見圖10。
[0057] 催化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮：反應(yīng)體系包含50mmol/L甘油，0.2mmol/LNAD+， 100mm〇l/L磷酸緩沖液（pH8.0)，催化劑使用步驟5)所制備的固定化甘油脫氫酶-輔酶氧 化酶融合酶多酶耦聯(lián)體系和相等酶濃度的游離酶體系，30°C，200rpm反應(yīng)2h，取樣離心，檢 測(cè)上清液二羥基丙酮含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6,可以看出固定化甘油脫氫酶-輔酶氧化酶融合 酶多酶耦聯(lián)體系的轉(zhuǎn)化率為73. 2%，游離酶體系為32. 5%，證明采用聚乙烯亞胺金屬配位 固定化甘油脫氫酶-輔酶氧化酶多酶耦聯(lián)體系能提高酶的催化活性與多酶耦聯(lián)的效率。
[0058] 實(shí)施例4
[0059] 1)工程菌的構(gòu)建：采用實(shí)施例2中制備的可表達(dá)甘油脫氫酶GDH的工程菌 E. coli BL21 (DE3)/pET32a和實(shí)施例1中制備的可表達(dá)輔酶氧化酶N0X的工程菌E. coli BL21(DE3)/pET32a；
[0060] 2)~3)實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例1和2的步驟2)~3)，制備得到甘油脫氫酶和輔酶氧 化酶；
[0061] 4)配置聚乙烯亞胺-金屬溶液：配置濃度為5mg/ml的支鏈PEI(分子量187KDa) 溶液，向該溶液中加入氯化媽溶液并使其終濃度為〇. 〇5mmol/L，配成混合溶液，4°C保 溫2h，離心除去上清，沉淀重懸于1~100mmol/L的pH6. 0~8. 0的磷酸緩沖液或1~ 100mmol/L的pH8. 0~10的氨水-氯化銨緩沖液中，得到聚乙烯亞胺-金屬溶液；
[0062] 5)固定化多酶體系制備：將含有步驟3)中得到的甘油脫氫酶和輔酶氧化酶的濃 度均為0? 2mg/ml的Tris-HCl(0? 05M，pH7. 0)酶溶液以4:1的比例加入至步驟4)中得到的 聚乙烯亞胺-金屬溶液，同時(shí)不斷攪拌孵化，形成固定化顆粒，離心分離，并用去離子水沖 洗，重懸于Tris-HCl(0.05M，pH7.0)緩沖液中，形成聚乙稀亞胺金屬配位固定化甘油脫氫 酶和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系，甘油脫氫酶和輔酶氧化酶的包埋率分別為85. 6%和94. 5%，酶 活分別為5.541]/1^和2.391]/11^，相比于游離酶活性分別提高了110.7%和54.2%，其5￡1 形態(tài)見圖7。
[0063] 6)催化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮：原理、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及底物甘油的濃度檢測(cè)同實(shí) 施例3,反應(yīng)體系包含50mmol/L甘油，0. 2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸緩沖液（pH8. 0)， 催化劑使用步驟5)所制備的固定化甘油脫氫酶和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系和相等酶濃度的 游離酶體系，30°C，200rpm反應(yīng)2h，取樣離心，檢測(cè)上清液二羥基丙酮含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖 8,可以看出固定化甘油脫氫酶和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系的轉(zhuǎn)化率為65. 2%，游離酶體系為 27.0%，證明采用聚乙烯亞胺金屬配位固定化甘油脫氫酶和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系能提高酶 的催化活性與多酶耦聯(lián)的效率。
[0064] 實(shí)施例5
[0065] 1)~3)實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例4的步驟1)~3);
[0066] 4)配置聚乙烯亞胺-金屬溶液：配置濃度為5mg/ml的支鏈PEI(分子量25KDa)溶 液，向該溶液中加入氯化銅溶液并使其終濃度為0. 5mmol/L，配成混合溶液，4°C保溫2h，離 心除去上清，沉淀重懸于1~l〇〇mmol/L的pH6. 0~8. 0的磷酸緩沖液或1~100mmol/L 的pH8. 0~10的氨水-氯化銨緩沖液中，得到聚乙烯亞胺-金屬溶液；
[0067] 5)固定化多酶體系制備：將含有步驟3)中得到的甘油脫氫酶和輔酶氧化酶的濃 度均為0? 5mg/ml的Tris-HCl(0? 1M，pH7. 0)酶溶液以2:1的比例加入至步驟4)中得到的 聚乙烯亞胺-金屬溶液，同時(shí)不斷攪拌孵化，形成固定化顆粒，離心分離，并用去離子水沖 洗，重懸于Tris-HCl(0.05M，pH7.0)緩沖液中，形成聚乙稀亞胺金屬配位固定化甘油脫氫 酶和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系，甘油脫氫酶和輔酶氧化酶的包埋率分別為92. 3%和94. 3%，酶 活分別為 1. 48U/mg和 0? 27U/mg。
[0068] 6)催化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮：原理、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及底物甘油的濃度檢測(cè)同實(shí) 施例3,反應(yīng)體系包含50mmol/L甘油，0. 2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸緩沖液（pH8. 0)，催 化劑使用步驟5)所制備的固定化甘油脫氫酶和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系和相等酶濃度的游離 酶體系，30 °C，200rpm反應(yīng)2h，取樣離心，檢測(cè)上清液二羥基丙酮含量，固定化甘油脫氫酶 和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系的轉(zhuǎn)化率為78. 8%，游離酶體系為27. 0%，證明采用聚乙烯亞胺金 屬配位固定化甘油脫氫酶和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系能提高酶的催化活性與多酶耦聯(lián)的效率。
[0069] 實(shí)施例6
[0070] 1)~3)實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例4的步驟1)~3);
[0071] 4)配置聚乙烯亞胺-金屬溶液：配置濃度為100mg/ml的直鏈PEI(分子量217KDa) 溶液，向該溶液中加入氯化鎳溶液并使其終濃度為50mmol/L，配成混合溶液，4°C保溫4h， 離心除去上清，沉淀重懸于1~l〇〇mmol/L的pH6. 0~8. 0的磷酸緩沖液或1~lOOmmol/ L的pH 8.0~10的氨水-氯化銨緩沖液中，得到聚乙烯亞胺-金屬溶液；
[0072] 5)固定化多酶體系制備：將含有步驟3)中得到的甘油脫氫酶和輔酶氧化酶的濃 度均為10mg/ml的Tris-HCl(0. 1M，pH7. 0)酶溶液以1:1的比例加入至步驟4)中得到的 聚乙烯亞胺-金屬溶液，同時(shí)不斷攪拌孵化，形成固定化顆粒，離心分離，并用去離子水沖 洗，重懸于Tris_HCl(0. 05M，pH7. 0)緩沖液中，形成聚乙稀亞胺金屬配位固定化甘油脫氫 酶和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系，甘油脫氫酶和輔酶氧化酶的包埋率分別為85. 8%和98. 6%，酶 活分別為 6. 42U/mg和 0? 30U/mg。
[0073] 6)催化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮：原理、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及底物甘油的濃度檢測(cè)同實(shí) 施例3,反應(yīng)體系包含50mmol/L甘油，0. 2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸緩沖液（pH8. 0)，催 化劑使用步驟5)所制備的固定化甘油脫氫酶和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系和相等酶濃度的游離 酶體系，30 °C，200rpm反應(yīng)2h，取樣離心，檢測(cè)上清液二羥基丙酮含量，固定化甘油脫氫酶 和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系的轉(zhuǎn)化率為98. 6%，游離酶體系為27%，證明采用聚乙烯亞胺金屬 配位固定化甘油脫氫酶和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系能提高酶的催化活性與多酶耦聯(lián)的效率。
[0074] 實(shí)施例7
[0075] 1)~3)實(shí)驗(yàn)步驟如實(shí)施例4的步驟1)~3);
[0076] 4)配置聚乙烯亞胺-金屬溶液：配置濃度為5mg/ml的支鏈PEI(分子量25KDa)溶 液，向該溶液中加入氯化鎂溶液并使其終濃度為25mmol/L，配成混合溶液，4°C保溫2h，離 心除去上清，沉淀重懸于1~l〇〇mmol/L的pH6. 0~8. 0的磷酸緩沖液或1~100mmol/L 的pH8. 0~10的氨水-氯化銨緩沖液中，得到聚乙烯亞胺-金屬溶液；
[0077] 5)固定化多酶體系制備：將含有步驟3)中得到的甘油脫氫酶和輔酶氧化酶的濃 度均為5mg/ml的Tris-HCl(0. 1M，pH7. 0)酶溶液以2:1的比例加入至步驟4)中得到的聚 乙烯亞胺-金屬溶液，同時(shí)不斷攪拌孵化，形成固定化顆粒，離心分離，并用去離子水沖洗， 重懸于氨水-氯化銨（〇. 1M，pH8.0)緩沖液中，形成聚乙烯亞胺金屬配位固定化甘油脫氫 酶和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系，甘油脫氫酶和輔酶氧化酶的包埋率分別為95. 5%和91. 6%，酶 活分別為 2. 25U/mg和 0? 46U/mg。
[0078] 6)催化甘油生產(chǎn)二羥基丙酮：原理、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備及底物甘油的濃度檢測(cè)同實(shí) 施例3,反應(yīng)體系包含50mmol/L甘油，0. 2mmol/LNAD+，100mmol/L磷酸緩沖液（pH8. 0)，催 化劑使用步驟5)所制備的固定化甘油脫氫酶和輔酶氧化酶耦聯(lián)體系和相等酶濃度的游離 酶體系，30 °C，200rpm反應(yīng)2h，取樣離心