玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特異ssr標記及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特異SSR標記及其應用，屬于植 物育種技術領域。
【背景技術】
[0002] C4植物具有光呼吸低、氮素和水分利用效率高、光能利用效率高的優(yōu)點，C4光合相 關酶在對生物和非生物逆境（如機械創(chuàng)傷、低溫、鹽害及紫外輻射等）的防御反應中也有較 重要的作用。由于主要糧食作物如水稻、小麥等C3植物不具有這些優(yōu)勢，人們就希望將C4 這些優(yōu)勢特征引入水稻等c3作物中。PEPCase是C4途徑的關鍵酶，國內外對該基因的研究 報道也比較多，已有不少將玉米PEPC基因成功轉入水稻中的報道（Hudspeth等，1992;Ku 等，1999 ;焦德茂等，2001 ;李霞等，2001 ;王德正等，2002 ;何立斌等，2006 ;袁定陽等，2007 ; 向珣朝等，2009;周寶元等，2011;李萬昌等，2014)。這些轉基因水稻的0)2補償點和光呼吸 速率顯著降低，表觀凈光合速率提高，產量也有不同程度的提高。
[0003]為了加快轉玉米PEPC基因水稻的選育進程，利用分子標記進行輔助選擇是一種 比較快速、適用的技術。很多研究開發(fā)了玉米PEPC基因分子標記并進行基因檢測（劉峰等， 2005 ;何立斌等，2006 ;高東迎等，2006 ;袁定陽等，2007 ;丁在松等，2007 ;張邊江等，2008 ; 張彬等，2009;李艷等，2009;張慶琛等，2010;張建紅等，2012;杜西河等，2013)，但這些分 子標記的堿基序列要么位于非編碼區(qū)，要么跨疊非編碼區(qū)，不利于基因表達分析（轉基因 的重要目的之一就是希望目的基因能正常表達）；而且這些標記在不同玉米品種（系）之 間或者不同水稻品種之間存在著差異，不能快速、簡單、高效地區(qū)分所有玉米PEPC基因與 水稻PEPC基因的差異。由于PEPC基因廣泛存在于各種植物中，如玉米、高粱、稗草、栽培 稻、短花藥野生稻、大麥、普通小麥、狗尾草、弓果黍、蘆葦、二穗短柄草、松葉菊屬、羽毛針禾 等植物，但現(xiàn)在轉C4-PEPC基因的研究主要集中在轉不同玉米的PEPC基因上，且截止目前 還未見只針對玉米PEPC基因篩選通用分子標記的報道。本研究以經典玉米品系B73的 PEPC(NC_024463)基因為例進行開發(fā)玉米特異SSR標記的探索。該玉米PEPC基因包含10 個外顯子和9個內含子，首先將10個外顯子序列逐一在NCBI數據庫進行比對，發(fā)現(xiàn)這10 個外顯子不但在不同物種（如玉米、水稻、小麥、高粱、大麥、稗草等）之間存在著明顯的差 異，而且在不同玉米品種（系）之間都存在著一定差異，即使一些片段比較長的外顯子（如 第2、4、8、9和10外顯子）和片段大小一般的外顯子（如第1和5外顯子）在不同玉米品 種（系）上也存在著很多差異位點，如缺失、插入、錯配（相對于B73的堿基序列而言），導 致這些位置無法進行玉米特異SSR標記的設計；第3外顯子（936-1020,85bp)和第6外顯 子（2960-3047,88bp)不但片段比較?。ú贿m于SSR標記的設計），而且在不同玉米品系上 也存在著差異；最初比對第7外顯子（4717-4871，155bp)時發(fā)現(xiàn)黍族的Zuloagaeabulbosa 植物與該玉米在堿基序列一致，但仔細分析發(fā)現(xiàn)它在已知的玉米品種PEPC基因序列里面 至少有152bp(除與玉米品系Z561前3個堿基aat沒有比對上外，截止2015年6月22日 的NCBI數據）的序列是完全一致的，然而該外顯子在NCBI數據庫水稻基因組中也沒有發(fā) 現(xiàn)較為接近的比對結果。我們試著對該外顯子進行SSR引物設計，然后選擇不同玉米和水 稻品種進行PCR擴增，結果意外地發(fā)現(xiàn)該引物（命名為PC9)在所有玉米材料中都能擴增出 預期長度為131bp的片段（圖1)，而在所有不同水稻品種中則能擴增出大約340bp的片段 (圖2)，通過該引物完全可以區(qū)分水稻與玉米PEPC基因的差異，即可用于轉玉米PEPC基因 到水稻中的輔助選育，從而有利于加快育種進度和提高選擇效率。
[0004] 主要參考文獻：
[0005] 1.Hudspeth等，PlantPhysiology，1992,98 (2) : 458-464 ;
[0006] 2.Ku等，NatureBiotechnology，1999,17:76-80 ;
[0007] 3?焦德茂等，作物學報，2001，27(2) : 137-143 ;
[0008] 4.李霞等，江蘇農業(yè)學報，2001，17(3):143-147;
[0009] 5?王德正等，中國農業(yè)科學，2002,35(10) :1165-1170 ;
[0010] 6.劉峰等，應用與環(huán)境生物學報，2005，11(4):393-398
[0011] 7?高東迎等，江蘇農業(yè)學報，2006, 22(1) :5-9
[0012] 8.何立斌等，中國水稻科學，2006,20(1):31-35;
[0013] 9.袁定陽等，雜交水稻，2007,22(2):57-63;
[0014] 10.丁在松等，作物學報，2007,33(5):717-722
[0015] 11.張邊江等，中國農業(yè)科學，2008,41(10):3008-3014
[0016] 12?向珣朝等，中國水稻科學，2009,23⑶：257-262;
[0017] 13?張彬等，AgriculturalScience&Technology，2009,10 (2) :26_28
[0018] 14.李艷等，麥類作物學報，2009,29(5):740-746
[0019] 15?張慶琛等，麥類作物學報，2010, 30(2) : 194-197
[0020] 16?周寶元等，作物學報，2011，37(1) :112-118 ;
[0021] 17?張建紅等，麥類作物學報，2012, 32(6) : 1043-1049
[0022] 18.杜西河等，分子植物育種，2013,23(11):477-484
[0023] 19?李萬昌等，湖北農業(yè)科學，2014, 53(1) :23-24, 37

【發(fā)明內容】

[0024] 技術問題
[0025] 本發(fā)明的目的是提供玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特異SSR標記，旨在提 高轉任何玉米PEPC基因水稻分子標記輔助選擇的效率。
[0026] 技術方案
[0027] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案。
[0028] -種玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特異SSR標記，其特征在于，該標記PC9 的引物正反引物序列如下：
[0029]正向引物 5' -3' ：ATTCCTCCAAACGAGCCCTA，
[0030]反向引物 5' -3' ：CTGGTAAATGACGATTCCGC。
[0031] 所述玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特異SSR標記的應用，是指任何玉米磷 酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的特異SSR標記在水稻育種中的應用。包括以下步驟：
[0032] 1)提取水稻、玉米基因組DNA和/或RNA或cDNA;
[0033] 2)使用所述權利要求1所述基因標記PC9的引物正反引物序列PCR擴增水稻、玉 米基因組DNA和/或RNA或cDNA;
[0034] 3)電泳檢測擴增產物，如果出現(xiàn)131bp的單條帶，則表示水稻品種中含純合的玉 米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因；如果出現(xiàn)340bp的單條帶，則表示水稻品種中不含有玉 米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因；如果同時出現(xiàn)131bp和340bp兩個條帶，則表示水稻品種 為玉米磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因雜合體。
[0035] 其中，步驟2)中PCR擴增具體操作為：PCR擴增采用20yL反應體系：模板DNA或 RNAScDNA1.0yL，10XPCRBufTer(1.5mMMg2+)2.0yL，2m]\^9dNTP2.0yL，0.2y]\^9 引物 2. 0yL，Taq酶 1U，加ddH20 補至 20yL;
[0036]PCR擴增程序為：（1) 94°C預變性 5min;(2) 94°C變性 30s，53. 6°C退火 30s，72°C延 伸30s，擴增35個循環(huán)；（3) 72°C延伸lOmin，4°C保溫。
[0037] 有益效果
[0038] 本發(fā)明的優(yōu)點是：
[0039] 1)本發(fā)明的標記是根據玉米PEPC基因內部的堿基序列設計的引物，為基因自身 標記，故不存在遺傳交換，不需要作表型鑒定。
[0040] 2)由于PC9標記位于玉米PEPC基因的外顯子區(qū)域，無論是利用基因組DNA進行檢 測，還是利用RNA或cDNA進行表達檢測，都是準確可靠的。
[0041] 3)本發(fā)明的標記為共分離標記，可鑒別玉米PEPC基因的雜合體和純合體，實驗重 復性好，結果可靠。
[0042] 4)由于該標記兩端所在的DNA序列在所有玉米品種（系）基因組中高度保守一 致，該標記具有專一性與通用性，在轉任一玉米PPDK基因研究中無需再開發(fā)新標記即可利 用該標記進行分子標記輔助選擇。
[0043] 5)利用本發(fā)明的標記進行輔助選擇育種，不僅節(jié)約成本，而且能夠準確、高效地將 玉米高光效PEPC基因轉育到C3植物水稻中。
【附圖說明】
[0044] 圖1為玉米PEPC基因第7外顯子堿基序列，下劃線箭頭表示標記PC9的前后引物 序列位置；
[0045] 圖2為標記PC9對22個水稻或玉米材料的基因型檢測結果。M為50bpDNA marker，1~22分別為：普通玉米、懦玉米、Kitaake、轉PEPC基因Kitaake-1 (PCI)、轉 PPDK基因Kitaake-1 (PK1)、轉PEPC基因Kitaake-2 (PC2)、轉PPDK基因Kitaake-2 (PK2)、 轉ME基因Kitaake(PME)、R299、轉PEPC+PPDK雙基因R299 (T299-1)、轉PEPC+PPDK雙基因 R299(T299-2)、9311、蜀恢881、黃華占、廣恢 128、R6547、中佳早 2 號、Dular、日本晴、02428、 武運粳8號、寧粳3號
【具體實施方式】
[0046]1、供試材料
[0047]
[C
[0049] 2.DNA提取
[0050] 在苗期取水稻葉片，基因組DNA的提取參照Xin等（Xinetal.，BioTechniqu es，2003, 34:820-826)簡便方法，具體如下：
[0051] 1)用打孔器打取新鮮水稻或玉米葉片約30mm2,轉入96孔PCR擴增板中；
[0052] 2)每管加入 50uL新鮮配制的bufferA