一種特異結(jié)合癌癥標(biāo)志物鈣網(wǎng)蛋白的核酸適體及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種特異結(jié)合癌癥標(biāo)志物鈣網(wǎng)蛋白，屬于生物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] f丐網(wǎng)蛋白（Calreticulin)發(fā)現(xiàn)至今已有十多年，其主要功能是藏f丐。人媽網(wǎng)蛋 白基因的編碼序列有1251個(gè)核苷酸，核苷酸序列見(jiàn)GenBank No:匪004343,編碼的鈣網(wǎng)蛋 白由417個(gè)氨基酸組成。近年發(fā)現(xiàn)其N-端具有抗腫瘤的作用，已證明鈣網(wǎng)蛋白的N-端第 1-180 位氨基酸[J Exp Med，1998; 188 (12) :2349-2356]或第 120-180 位氨基酸[Blood， 1999 ;94(7) :2461-2468]組成的蛋白質(zhì)可通過(guò)抑制腫瘤的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)而發(fā) 揮抗腫瘤作用。目前該基因可從生物技術(shù)公司（http://www.invivogen.com)獲得。在腫 瘤發(fā)生時(shí)，分泌性的CRT在肝癌病人的血清以及膀胱癌患者的尿液中都有上升趨勢(shì)，除此 之外，對(duì)婦科腫瘤如乳腺癌、宮頸癌的研宄也顯示相比健康對(duì)照CRT的表達(dá)量有所增加；用 免疫組化染色研宄胃癌時(shí)發(fā)現(xiàn)CRT陽(yáng)性的患者往往伴有遠(yuǎn)處淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移、腫瘤微血管 聚集以及五年存活率低下的癥狀。然而，由于腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制至今尚未闡明，因此腫 瘤的早期發(fā)現(xiàn)也變得越來(lái)越重要。
[0003] 在腫瘤的研究和臨床實(shí)踐中，早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療是關(guān)鍵。腫瘤標(biāo)志物 (Tumor Marker，TM)在腫瘤普查、診斷、判斷預(yù)后和轉(zhuǎn)歸、評(píng)價(jià)治療療效和高危人群隨訪觀 察等方面都具有較大的實(shí)用價(jià)值。隨著單克隆抗體技術(shù)的不斷成熟，出現(xiàn)了大量的抗腫瘤 標(biāo)志物的單克隆抗體，并與特異敏感的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)（RIA、IRMA、ELISA、CLIA、IFA、TRFIA 等）相結(jié)合，發(fā)展了眾多的腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)項(xiàng)目并不斷地應(yīng)用于臨床，已成為腫瘤患者的一 個(gè)重要檢查指標(biāo)。現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)有選擇CRT作為腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行方法學(xué)的建立及臨床試 驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)腫瘤病人血清中的CRT水平明顯高于正常對(duì)照。并且建立了針對(duì)于腫瘤診斷的CRT 抗體檢測(cè)的ELISA試劑盒。但是制備相應(yīng)的抗體比較復(fù)雜，成本也高，并不利于大規(guī)模的推 廣應(yīng)用。
[0004] 核酸適體（Aptamer,又稱適配體，適配子)是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生 物革E1標(biāo)的單鏈寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技 術(shù)（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)從人工合 成的DNA/RNA文庫(kù)中篩選得到的能夠高度特異性結(jié)合靶標(biāo)分子的單鏈DNA/RNA。已報(bào)道核 酸適體的靶標(biāo)包括金屬離子、有機(jī)小分子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等。核酸適體的分子 識(shí)別功能與抗體類似，具有與抗體分子相當(dāng)甚至更強(qiáng)的靶標(biāo)識(shí)別能力，但與抗體相比具有 很多優(yōu)良的特性，如分子量小，能批量生產(chǎn)，不易失活，無(wú)免疫原性、容易合成與標(biāo)記、快速 的穿透組織、良好的代謝動(dòng)力學(xué)、不同批次之間產(chǎn)品不會(huì)存在差異和具有很好化學(xué)穩(wěn)定性， 在生物檢測(cè)、疾病診斷治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種特異結(jié)合鈣網(wǎng)蛋白的核酸適體及其試劑盒。
[0006] 本發(fā)明提供的核酸適體，是如下序列所示： 序列表的序列1-30所示的單鏈DNA。
[0007] GWDB-1 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCCCTTTACTATCCGCCATCATCTTATCATAAGACTTT CTTCTGAACGTTCTCACGCA-3' ； GWDB-2 :5'-ACGTTCGGATCGCACTAGAGCAACATTCCCGCCTTTACTATCCCCATCATCTGTATCACTTCT GAACGTTCTCACGCA-3,； GffDB-3 ：5? -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTTCACTAACCCAATTGTTTAACCCACCACCACAAGAACTTC TGAACGTTCTCACGCA-3,； GffDB-4 ：5? -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCCCAATTGTTTAACCCACCACCACAAGAATCAACAATCTTC TGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-5 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTACCTGCCAATTACCCTTACCGACCTACACAATCTATCTTC TGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-6 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCAATCATGCTCCATCTACTTAATTACCGCCCTCTTCAACTTC TGAACGTTCTCACGCA-3,； GffDB-7 ：5? -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTCACAGACAAATCTAACCTCCTAAGAACATTTAACACCTTC TGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-8 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTCTCTCACTCCGCCTATCCACAATGTTTAATACAAATCTTC TGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-9 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTATTATGTTATAACACATCACGACCATCTCATCATCTCTTC TGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-10 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCTAACTGTACATCTAACACTCTATCTCAGAACCTTTTCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-11 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCACCCTGCTCTAAACACTTTACACCTGTCCCAAATCCCCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-12 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTACATGTTATTTCACTTTGTCCTCACCACTATACTTACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-13 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCACACACCTGTTTACCTCCAATTACCCGTTACCACCTACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-14 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCATTATTAGACCACTTCCAAAATCTCGTCTCCCATATTCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-15 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTACTCTCGTCTCAATCTACACCCCCGACCATCTACCACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-16 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCACTAGATACTTCCACCAAATCGTCAAAACCCATTCTCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-17 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCAATTCCCTGAACAACTACAACCTGCTATAATCTTTATCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-18 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCCTACTTCGCTATTACTTTTCTACCAACTCCTTGTTCCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-19 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTAACCTTGTCCTCCCAACACACCATGTTTATAACCAACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GffDB-20 ：5? -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCACTAACTGTAATCCTCATTTCTCAGATTCCCAACTTCCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-21 :5 ' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCTCCCAGTACTTACCACTAACCAATCAGCAATACATTCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-22 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCTCCCGTTCCTCTACTAATCAAACTGCTTACCCACCCTCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GffDB-23 ：5? -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCACTACGAATATCTTTTATCTTAATACAGCTTACATTACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-24 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCCGCCCTCCACACCTCTCCCCTTACATTGTTATCCTACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-25 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCTCCGATCACTACCATTAACTCTAACACTTGTCCCCCCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-26 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCTCATTGTCCATATTCTCCTTCCCCATTAGAATCACACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-27 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCAATGTTCACAACAAATCTAACCTCCTAAAGACATTTACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-28 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCAATACCGCATAAACTTAAATCTCAGACTCCTACAACACTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-29 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCTACTTACCCACTTTCTTGTTAATAAGACGATACCTCCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3,； GWDB-30 :5' -ACGTTCGGATCGCACTAGAGCCCAAATCTCAGAAACCCATTCTCTACACACCTTGTACCTT CTGAACGTTCTCACGCA-3, 〇
[0008] 所述核酸適體與鈣網(wǎng)蛋白CRT具有較好的親和能力。
[0009] 還可將所述核酸適體進(jìn)行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。
[0010] 所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種： a) 將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補(bǔ)的核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相 同功能的核酸適體的衍生物； b) 將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能 的核酸適體的衍生物； c) 將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功 能的核酸適體的衍生物； d) 將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生 物； e) 將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質(zhì)后