在馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷型菌株中使用的重組載體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種重組載體，尤其涉及一種在馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷型菌株中 使用的重組表達載體。
【背景技術】
[0002] 酵母是單細胞的真核生物，它兼具微生物的特性和真核生物的蛋白合成加工系 統(tǒng)。因此，它被廣泛的用于表達多種外源真核蛋白。目前主流的酵母表達系統(tǒng)包括畢赤酵 母和釀酒酵母表達系統(tǒng)。但是，畢赤酵母的蛋白表達需要用甲醇誘導，不適合用于食用蛋白 的生產(chǎn)。釀酒酵母易產(chǎn)乙醇，生長密度低，表達水平偏低。針對這一系列問題，發(fā)展新型的 安全性高和產(chǎn)量高的酵母表達系統(tǒng)具有很高的工業(yè)價值。
[0003] 馬克思克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus)已經(jīng)通過了美國和歐洲的GRAS 和QPS安全認證，其自身不僅被認為是安全的微生物菌株，同時也被認為是可用于制備食 品級重組蛋白（酶）的安全微生物菌株，是一種被歐盟認可的食品級的酵母。它具有營養(yǎng) 要求極其簡單、生長旺盛、生物量大、生長溫度適應范圍廣等特點。同時，它還具有高效分泌 蛋白的特點。因此，馬克思克魯維酵母具有高效表達食用和飼用蛋白的巨大潛力。
[0004] 表達系統(tǒng)由宿主菌和表達載體構成。對于食品安全級別的酵母表達系統(tǒng)，宿主菌 通常選用營養(yǎng)缺陷型標記。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種在馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷型菌株中使用、進行外源基因表 達的重組表達載體。
[0006] 本發(fā)明第一個方面是提供一種在馬克思克魯維酵母營養(yǎng)缺陷型菌株中使用的重 組載體，按照順序包括PKD1載體、菊粉酶啟動子、菊粉酶信號肽、多克隆位點、菊粉酶終止 子、營養(yǎng)基因啟動子、營養(yǎng)基因開放閱讀框（0RF)。
[0007] 其中，所述營養(yǎng)基因優(yōu)選為馬克斯克魯維菌株的營養(yǎng)基因，如URA3基因、HIS3基 因、ADE2基因中的任意一種或幾種，更優(yōu)選為URA3基因。
[0008] 其中，所述多克隆位點可以是包括一個或多個位點限制性酶切位點的序列，所述 限制性酶切位點如SmaI、XmaI、SpeI、NotI中的任意一種或幾種，更優(yōu)選為SpeI、NotI、以及 Smal和/或Xmal中的任意一種或幾種，如Smal/Xmal、Spel、Notl。
[0009] 其中，所述多克隆位點長度優(yōu)選為15_25bp，更優(yōu)選為18_23bp，更優(yōu)選為 19-21bp〇
[0010] 在本發(fā)明的一種優(yōu)選實施例中，所述重組載體的DNA序列如SEQ ID No. 1所示。
[0011] 本發(fā)明第二個方面是提供一種構建上述重組載體的方法包括：
[0012] 擴增pUC19質粒、PKD1載體，獲得pUC19與PKD1連接的片段I ;
[0013] 擴增馬克思克魯維酵母基因組，獲得包含營養(yǎng)基因啟動子或0RF的片段II ;
[0014] 擴增馬克思克魯維酵母基因組，獲得包含菊粉酶基因啟動子、菊粉酶信號肽、和部 分多克隆位點的片段III;
[0015] 擴增馬克思克魯維酵母基因組，獲得包含菊粉酶終止子和部分多克隆位點的片段 IV，
[0016] 將片段I、II、III、IV進行連接，獲得第一重組載體；
[0017] 步驟 2，
[0018] 擴增第一重組載體，得到含有菊粉酶啟動子，多克隆位點，菊粉酶終止子，營養(yǎng)基 因啟動子和營養(yǎng)基因0RF的片段A ;
[0019] 擴增第一重組載體，得到包含PKD1序列的片段B ;
[0020] 步驟 3，
[0021] 將片段A和片段B連接，轉化營養(yǎng)缺陷型菌株，獲得轉化子；
[0022] 抽提并擴增轉化子基因組，分離出含有片段A和片段B的所述重組載體。
[0023] 其中，步驟2中，獲得片段A過程中的擴增引物為：
[0024] 5'-CCGTGCCGATTCGCACGCTGCAACG-3 ;
[0025] 5'-TGATGCATGCCGAGCTCGGTACCCCTCTTAAGCGG-3' 。
[0026] 其中，步驟2中，獲得片段B過程中的擴增引物為：
[0027] 5'-ACCGAGCTCGGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACG-3 ;
[0028] 5'-CGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3' 〇
[0029] 其中，步驟3中，獲得片段C過程中的擴增引物為：
[0030] 5'-ACAAAGGTGATGCTTTGGGACA-3 ;
[0031] 5'-GCTTCTTACGTTACGGTTATGGAGC-3' 。
[0032] 其中，擴增pUC19質粒的引物優(yōu)選為：
[0033] 正向引物：
[0034] 5'-GAGGGGTACCGAGCTCGAATTAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCT GTTTCCT-3' ；
[0035] 反向引物：
[0036] 5'-TACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCT-3' 。
[0037] 其中，擴增PKD1質粒的引物優(yōu)選為：
[0038] 正向引物：
[0039] 5'-CCAAGCTTGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACGACGCC-3' ；
[0040] 反向引物：
[0041] 5'-AATTCGAGCTCGGTACCCCTCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3' 。
[0042] 其中，在一種優(yōu)選實施例中，獲得pUC19與PKD1連接的片段I方法如下：擴增 PUC19質粒得到A片段，擴增Gateway系統(tǒng)載體的pcYGW獲得B片段，擴增PKD1載體獲得 C片段，將A、B和C片段連接，將連接得到的質粒進行擴增，得到包括pUC19與PKD1的片段 1〇
[0043] 其中，擴增pcYGW所用引物優(yōu)選為：
[0044] 正向引物：5' -GAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTG-3' ；
[0045] 反向引物：5' -GCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCG-3'。
[0046] 其中，擴增質粒的引物優(yōu)選為：
[0047] 正向引物：5' -GATCCGCTTAAGAGGGGTACCGAGCTCGAATT-3' ；
[0048] 反向引物：
[0049] 5'-ACCTTTTCGGATCGGCATGCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3' 。
[0050] 其中，擴增獲得片段II的引物優(yōu)選為：
[0051] 正向引物：5'-CTAGGATCGGTCGAATTCTGATTGGAAAGACCATT-3' ；
[0052] 反向引物：5' -GTACCCCTCTTAAGCGGATCTGCCTACTCTCTTCA-3'。
[0053] 其中，擴增獲得片段III的引物優(yōu)選為：
[0054] 正向引物：5'-GCATGCCGATCCGAAAAGGTAAACAGACAC AAAAAC-3' ；
[0055] 反向引物：
[0056] 5'-GTCCCGGGGTCACCGTCTCTCTTGTAATTGATCACTGAAG-3' 。
[0057] 其中，擴增獲得片段IV的引物優(yōu)選為：
[0058] 正向引物：
[0059] 5'-ACGGTGACCCCGGGACTAGTGCGGCCGCTTAAGGCCGCAAGCTTTGA TCTG-3' ；
[0060] 反向引物：5' -CAGAATTCGACCGATCCTAGAATGTTGGTCAGATGTG-3'。
[0061 ] 在本發(fā)明一種優(yōu)選實施例中，所述方法還包括：
[0062] 擴增獲得含有酵母alpha因子信號肽的片段，作為引物對所得重組載體進行突 變。
[0063] 其中，優(yōu)選地，擴增PPIC9K載體獲得含有所述酵母alpha因子信號肽的片段。
[0064] 其中，擴增PPIC9K所用引物優(yōu)選為：
[0065] 正向引物：
[0066] 5 ? -CCCATAAGTGACACATTTAATTTTTTTTTTGTTAGATATGAGATTTCCTTC AATTTTTACTGC-3' ；
[0067] 反向引物：
[0068] 5' -CTAGTCCCGGGGTCACCGTCGTAAGCTTCAGCCTCTCTTTTCTCG-3'。
[0069] 本發(fā)明第三個方面是提供一種轉化子，將外源基因插入到所述重組載體的多克隆 位點中，獲得含有外源基因的質粒，將所述質粒轉入營養(yǎng)基因缺陷型菌株中，獲得所述轉化 子。
[0070] 在一種優(yōu)選實施例中，將外源基因插入到權利要求1所述重組載體的多克隆位點 的方法包括：
[0071] 擴增所述重組載體，得到片段D，擴增引物為：
[0072] --正向引物 5' -GGCCGCAAGCTTTGATCTGATCTGCTTAC-3' ；
[0073] --反向引物 5, -CTTGTAAITGATCACTGAAGCACTGACTCC-3'
[0074] 擴增外源基因0RF的正向引物的5'端添加5' -CTTCAGTGATCAATTACAAG-3'的序列； 在擴增外源基因0RF的反向引物的5'端添加5' -TCAGATCAAAGCTTGCGGCC-3'的序列；擴增 得到片段E;
[0075] 將片段D和E進行連接。
[0076] 其中，所述營養(yǎng)基因缺陷型菌株優(yōu)選為營養(yǎng)基因缺陷型馬克斯克魯維菌株。
[0077] 所述營養(yǎng)基因缺陷優(yōu)選為包括URA3基因、HI S3基因、ADE2基因缺陷中的任意一種 或幾種，更優(yōu)選為URA3基因缺陷。
[0078] 本發(fā)明構建的用于外源基因分泌表達的重組載體、及其制備方法，可用于構建轉 化子，來實現(xiàn)外源基因的表達。
【附圖說明】
[0079] 圖1為本發(fā)明實施例1中所構建重組載體原理圖。
【具體實施方式】
[0080] 步驟1，構建第一重組載體
[0081] 1. 1、擴增 pUC19 質粒
[0082] 正向引物：
[0083] 5'-GAGGGGTACCGAGCTCGAATTAGCTCGAATTCGTAATCATGTCATAGCT GTTTCCT-3'
[0084] 反向引物：5' -TACAATTTTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCT-3'
[0085] 利用所述引物擴增pUC19質粒。PCR擴增反應按照Vazyme公司的Phanta Super Fidelity DNA Polymerase的使用說明書進行，退火溫度為58°C，延伸時間為3分鐘，30個 循環(huán)。PCR產(chǎn)物命名為A1片段。
[0086] 1. 2,擴增 Gateway 系統(tǒng)載體的 pcYGW
[0087] 正向引物：5' -GAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTG-3'
[0088] 反向引物：5, -GCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCG-3'
[0089] 利用所述引物擴增Gateway系統(tǒng)載體的pcYGW。PCR擴增條件同步驟1，除了延伸 時間為1分鐘。PCR產(chǎn)物命名為B1片段。
[0090] 1.3,擴增 PKD1 載體
[0091] 正向引物：5'-CCAAGCTTGCATGCATCACTAATGAAAAGCATACGACGCC-3' 反向引物：
[0092] 5'-AATTCGAGCTCGGTACCCCTCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3'
[0093] 利用所述引物擴增PKD1載體。PCR擴增條件同步驟1，除了延伸時間為5分鐘。 PCR產(chǎn)物命名為C1片段。
[0094] 1.4，連接片段厶1、81、(：1
[0095] 按照NEB公司Gibson Assembly Master Mix的使用說明書操作，將片段Al、B1、 C1連接，轉化大腸桿菌，獲得的質粒命名為HJC19-PKD1。
[0096] 1. 5,擴增 PUC19-PKD1 質粒
[0097] 正向引物：5' -GATCCGCTTAAGAGGGGTACCGAGCTCGAATT-3'
[0098] 反向引物：
[0099] 5'-ACCTTTTCGGATCGGCATGCCGTTGCAGCGTGCGAATCGGCACGG-3'