轉(zhuǎn)化的佛甲草外植體的培養(yǎng)
[0049]以21天為I個(gè)繼代，不斷將2cm高芽枝切下轉(zhuǎn)接1/2MS培養(yǎng)基相同條件下培養(yǎng)，擴(kuò)繁無(wú)菌苗；從無(wú)菌苗分別切取葉片、葉柄、莖節(jié)為外植體，以供根癌農(nóng)桿菌浸染所用。
[0050]實(shí)施例4:含有目標(biāo)基因植物表達(dá)載體的工程菌種的制備
[0051]1、根癌農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA1301菌液的制備
[0052]通過(guò)凍融法將pCAMBIA1301載體(pCAMBIA1301載體含有由CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)β-葡萄糖醛糖苷酶報(bào)告基因gus和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶篩選基因hpt作為篩選基因，目標(biāo)基因可根據(jù)育種目標(biāo)需要置于CaMV 35S啟動(dòng)子后面(圖2)，本實(shí)施例以β-葡萄糖醛糖苷酶報(bào)告基因gus作為實(shí)驗(yàn)測(cè)試基因)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌ΕΗΑ105，然后接種在含有50mg Γ1卡那霉素和50mg Γ1利福平的YEP培養(yǎng)基中，28°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，通過(guò)離心收集菌液，將菌細(xì)胞懸浮在含有20mg I 1乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基(pH5.2)中，0D600 = 0.4?0.5，由此得到含有PCAMBIA1301載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105菌液，命名為根癌農(nóng)桿菌EHA105/PCAMBIA1301。
[0053]2、根癌農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA3301菌液的制備
[0054]通過(guò)凍融法將pCAMBIA3301載體(pCAMBIA3301載體含有由CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)β -葡萄糖醛糖苷酶報(bào)告基因gus和草胺磷抗性基因bar作為篩選基因，目標(biāo)基因可根據(jù)育種目標(biāo)需要置于CaMV 35S啟動(dòng)子后面，本實(shí)施例以β -葡萄糖醛糖苷酶報(bào)告基因gus作為實(shí)驗(yàn)測(cè)試基因)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，然后接種在含有50mg Γ1卡那霉素和50mgΓ1利福平的YEP培養(yǎng)基中，28°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，通過(guò)離心收集菌液，將菌細(xì)胞懸浮在含有20mg I 1乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基(pH5.2)中，0D600 = 0.4?0.5，由此得到含有PCAMBIA3301載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105菌液，命名為根癌農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA3301。
[0055]3、根癌農(nóng)桿菌EHA105/pBI121菌液的制備
[0056]通過(guò)凍融法將pBI121載體(pBI121載體含有由CaMV 35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)β -葡萄糖醛糖苷酶報(bào)告基因gus和卡那霉素抗性基因NPT II作為篩選基因，目標(biāo)基因可根據(jù)育種目標(biāo)需要置于CaMV 35S啟動(dòng)子后面，本實(shí)施例以β -葡萄糖醛糖苷酶報(bào)告基因gus作為實(shí)驗(yàn)測(cè)試基因)導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，然后接種在含有50mg Γ1卡那霉素和50mg I—1利福平的YEP培養(yǎng)基中，28°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，通過(guò)離心收集菌液，將菌細(xì)胞懸浮在含有20mgI 1乙酰丁香酮的MS液體培養(yǎng)基(pH5.2)中，0D600 = 0.4?0.5，由此得到含有pBI121載體的根癌農(nóng)桿菌EHA105菌液，命名為根癌農(nóng)桿菌EHA105/pBI121。
[0057]實(shí)施例5:轉(zhuǎn)pCAMBIA1301的抗潮霉素再生植株的獲得
[0058]將實(shí)施例3制備的外植體浸泡于由實(shí)施例4制備的根癌農(nóng)桿菌EHA105/PCAMBIA1301菌液中，時(shí)間為10分鐘，取出外植體，置于無(wú)菌紙上吸干多余的菌液，后將外植體移至共培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基添加Img I 1BAJ.1mg I 1NAA和20mg I 1乙酰丁香酮，pH為5.5)，置25±1°C，黑暗下培養(yǎng)3天。取出共培養(yǎng)后的外植體，用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%吐溫80的無(wú)菌水沖洗5?6次，最后用含有500mg I 1頭孢霉素的無(wú)菌水沖洗一次，置外植體于無(wú)菌紙，吸干水，將外植體移至抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基添加Img I 1BAj.1mgI1NAAUOmg I 1潮霉素和500mg I 1頭孢霉素，pH為5.8)。置25 ± I °C，光下培養(yǎng)18天。
[0059]將帶有抗性芽的外植體(圖3)轉(zhuǎn)移至相同的新鮮抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)2周后轉(zhuǎn)接至抗性芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基(1/2MS培養(yǎng)基添加1mg I 1潮霉素和250mgI 1頭孢霉素，PH為5.8)，置25土 1°C，光下培養(yǎng)，可觀察到抗性芽的伸長(zhǎng)和不定根的大量產(chǎn)生。由此獲得轉(zhuǎn)PCAMBIA1301的抗潮霉素再生植株(抗性植株)。
[0060]實(shí)施例6 -M PCAMBIA3301的抗草胺磷再生植株的獲得
[0061]將實(shí)施例3制備的外植體浸泡于由實(shí)施例4制備的根癌農(nóng)桿菌EHA105/PCAMBIA3301菌液中，實(shí)驗(yàn)操作與實(shí)施例5相同，不同的是，所用的抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基成分為:MS培養(yǎng)基添加Img I 1BAJ.1mg I 1NAAjmg I 1草胺磷和500mg I 1頭孢霉素，pH為5.8 ;所用的抗性芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基成分為:1/2MS培養(yǎng)基添加5mg I 1草胺磷和250mg I 1頭孢霉素，pH為5.8。由此獲得轉(zhuǎn)pCAMBIA3301的抗草胺磷再生植株(抗性植株)。
[0062]實(shí)施例7 ??轉(zhuǎn)pBI121的抗卡那霉素再生植株的獲得
[0063]將實(shí)施例3制備的外植體浸泡于由實(shí)施例4制備的根癌農(nóng)桿菌EHA105/pBI121菌液中，實(shí)驗(yàn)操作與實(shí)施例5相同，不同的是，所用的抗性芽誘導(dǎo)篩選培養(yǎng)基成分為:MS培養(yǎng)基添加Img I 1BAj.1mg I 1NAAUOOmg I 1卡那霉素和500mg I 1頭孢霉素，pH為5.8 ;所用的抗性芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基成分為:1/2MS培養(yǎng)基添加10mg I 1卡那霉素和250mg I 1頭孢霉素，pH為5.8。由此獲得轉(zhuǎn)pBI121的抗卡那霉素再生植株(抗性植株)。
[0064]實(shí)施例8:轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測(cè)
[0065]由于pCAMBIA1301含有g(shù)us報(bào)告基因，可按Jefferson等(1987)的⑶S染色方法進(jìn)行染色檢測(cè)gus基因的表達(dá)情況。取與根癌農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA1301共培養(yǎng)3天之后的外植體、抗性芽、未轉(zhuǎn)化芽枝和轉(zhuǎn)化芽枝分別浸于X-Gluc染色液中，于37°C保溫3?5小時(shí)，用70%乙醇脫色，觀察藍(lán)色著色情況?？梢?jiàn)與根癌農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA1301共培養(yǎng)3天之后的外植體(圖4)表面有明顯的藍(lán)斑，說(shuō)明根癌農(nóng)桿菌EHA105/pCAMBIA1301能吸附浸染佛甲草外植體，抗性芽(圖5)和轉(zhuǎn)化芽枝(圖6)也均呈現(xiàn)藍(lán)色，而未轉(zhuǎn)化芽(圖6)則沒(méi)有呈現(xiàn)藍(lán)色，說(shuō)明通過(guò)以上操作，gus基因已成功地導(dǎo)入了佛甲草并在轉(zhuǎn)化株中穩(wěn)定表達(dá)。采用篩選基因hpt的特異性引物:HFw(5’ -CGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTC-3’ )和HRe(5’-GCTGGGGCG TCGGTTTCCACTATCGG-3’)合成探針，通過(guò) Southern 雜交的方法，在抗性植株Tl、T2、T3、T4、T5中均能觀察到雜交信號(hào)，而且?guī)筒灰粯?圖7)，說(shuō)明Tl、T2、T3、T4、T5均為不同的轉(zhuǎn)基因株系，而未轉(zhuǎn)化株WT(野生型)沒(méi)有信號(hào)，再次說(shuō)明通過(guò)以上該方法，hpt基因已成功地導(dǎo)入了佛甲草的基因組。
[0066]pCAMBIA1301、pCAMBIA3301和pBI121均含有g(shù)us報(bào)告基因，對(duì)實(shí)施例5-7獲得的轉(zhuǎn)PCAMBIA1301的抗潮霉素再生植株、轉(zhuǎn)pCAMBIA3301的抗草胺磷再生植株、轉(zhuǎn)pBI121的抗卡那霉素再生植株，通過(guò)⑶S染色方法檢測(cè)其gus基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)分別經(jīng)1mg I 1潮霉素、5mg I1草胺磷、10mg I 1卡那霉素篩選壓得到的抗性植株均有⑶S染色，因此，佛甲草轉(zhuǎn)化時(shí)分別采用篩選壓1mg I1潮霉素、5mg