一種黑霉菌生產(chǎn)(s)-聯(lián)苯乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到黑霉菌細(xì)胞生物催化制備手性醫(yī)藥 中間體⑶_1-(聯(lián)苯-4-基）乙醇的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性（S)_l_(聯(lián)苯_4_基）乙醇是合成手性藥物、精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)藥品和其他特殊 材料的重要中間體。生物催化不對(duì)稱(chēng)反應(yīng)具有環(huán)境友好、條件溫和、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，作為 綠色高效制備手性化合物的優(yōu)先途徑，被越來(lái)越多地應(yīng)用于生產(chǎn)一些高附加值的手性化 合物。生物催化制備手性（s)-l_(聯(lián)苯-4-基）乙醇具有很好的應(yīng)用前景。
[0003]生物催化具有催化效率高、選擇性強(qiáng)、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點(diǎn)，是可持續(xù) 發(fā)展過(guò)程中替代和拓展傳統(tǒng)有機(jī)化學(xué)合成的重要方法。其中手性拆分和不對(duì)稱(chēng)合成是生物 催化最具吸引力的應(yīng)用領(lǐng)域。在作為生物催化劑的六大類(lèi)酶中，水解酶能夠催化動(dòng)力學(xué)拆 分外消旋體得到手性產(chǎn)品，在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來(lái)，氧化還原 酶在工業(yè)上的應(yīng)用得到了迅速增長(zhǎng)。目前，采用水解酶動(dòng)力學(xué)拆分法、生物還原法和生物 氧化法工業(yè)制備光學(xué)活性手性化合物的比例為4:2:1。
[0004]生物還原法相對(duì)于動(dòng)力學(xué)拆分法而言，最大的優(yōu)勢(shì)在于理論收率可達(dá)100%，原子 經(jīng)濟(jì)性好。然而生物還原反應(yīng)需要輔酶或輔因子的參與，一定程度上限制了其應(yīng)用。由于 輔酶依賴(lài)性的緣故，生物還原反應(yīng)中多釆用整細(xì)胞作為催化劑，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)輔酶循環(huán)再生的 同時(shí)免去了酶的分離純化步驟。
[0005] (S)_l_(聯(lián)苯_4_基）乙醇是合成手性藥物、精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)藥品的重要手性砌 塊，?，F(xiàn)有的方法普遍存在轉(zhuǎn)化率低、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴(yán)重缺陷， 難于進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將采用生物細(xì)胞催化制備（s)-l_(聯(lián)苯-4-基）乙醇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明采用黑霉菌細(xì)胞催化制備（S)-l_(聯(lián)苯-4-基）乙醇，反應(yīng)式如下：
4-乙?；?lián)苯（1)經(jīng)黑霉菌催化反應(yīng)，得到產(chǎn)物（S)-l_(聯(lián)苯-4-基）乙醇（2)。有 多種微生物可以催化此反應(yīng)，經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)篩選，最終確定采用黑霉菌作為催化劑，因?yàn)槠?催化反應(yīng)的效果最好，反應(yīng)收率、對(duì)映體過(guò)量率（ee%)均很高。
[0007]許多黑霉菌都可以進(jìn)行生物催化此反應(yīng)，然而，其效果不同，相差很大，經(jīng)實(shí)驗(yàn)，本 發(fā)明選用黑霉菌菌株為ATCC 34956，其催化反應(yīng)效果最佳。
[0008] 由于絕大多數(shù)氧化還原酶是輔酶NAD (P)H依賴(lài)型，而細(xì)胞本身所含有的輔酶量 可能較少，因此，進(jìn)行氧化還原反應(yīng)時(shí)，為促進(jìn)輔酶再生，提高反應(yīng)效率，在反應(yīng)體系中 還添加輔助底物構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系。常用的輔助底物種類(lèi)較多，不同細(xì)胞所需的輔助底物不同， 效果差別很大，采用幾種輔助底物組合，可以取得較好效果，需進(jìn)行大量實(shí)驗(yàn)才能確定最佳 的輔助底物。本發(fā)明經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)確定的輔助底物為：木糖20-24g/L、異丙醇5-6%V/V (體 積濃度）。
[0009] 由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。
[0010] 培養(yǎng)介質(zhì)： 1、種子培養(yǎng)基成份為：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，酵母提取物10 g/ L，葡萄糖20 g/L，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀1. 8-2. 3g/L;配制 固體培養(yǎng)基時(shí)添加15g/L的瓊脂粉。
[0011] 2、培養(yǎng)液成份：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，黃豆粉3-5g/L，酵母 浸膏6-9g/L，葡萄糖18-22 g/L，麥芽浸膏25-30 g，硫酸銨0? 5-0. 7g/L，硫酸鎂0? 3-0. 4g/ L，磷酸二氧鉀1.8-2. 3g/L，碳酸鈣0.7 g/L，硫酸亞鐵0.18 g/L，硫酸錳0.025 g/L; pH 5. 3〇
[0012] 2、固體培養(yǎng)基成份：在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
[0013] 黑霉菌細(xì)胞制備。黑霉菌經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液；發(fā)酵罐加入培養(yǎng) 液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至26-27°C，將黑霉菌種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為 10-11%，通氣比為0.9-1￥/(￥分鐘），26-27°(：培養(yǎng)35-40小時(shí)，用過(guò)濾式離心機(jī)離心得到 濕黑霉菌細(xì)胞，用作生物催化反應(yīng)催化劑。
[0014] 生物催化轉(zhuǎn)化。底部通氣攪拌反應(yīng)罐中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6.1，加入底 物4-乙?；?lián)苯，使底物濃度為80-90 g/L。其他成份：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為 19-20g/L，山梨坦單月桂酸酯7-9g/L，木糖20-24g/L、異丙醇5-6%V/V (體積濃度），121°C 高壓滅菌30分鐘；冷卻至32-33 °C時(shí)，加入濕黑霉菌細(xì)胞使其濃度為6l-64g/L，通氣比為 0. 12-0. 13V/(V分鐘)，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為56-59小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，濾出細(xì)胞， 用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物（S)-1-(聯(lián)苯-4-基）乙醇，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率 98-99 %，產(chǎn)品收率96-97 %，對(duì)映體過(guò)量率98. 5-99 %。
[0015] 本發(fā)明所開(kāi)展工作包括菌株選擇、催化反應(yīng)條件優(yōu)化(反應(yīng)溫度、通氣量、pH)、反 應(yīng)介質(zhì)選擇和濃度優(yōu)化，包括底物濃度、輔助底物組合、表面活性劑種類(lèi)及濃度等。
[0016] 實(shí)施例1 種子培養(yǎng)基成份為：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，酵母提取物10 g/L，葡 萄糖20 g/L，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀1. 8-2. 3g/L;配制固體 培養(yǎng)基時(shí)添加15g/L的瓊脂粉。
[0017]培養(yǎng)液成份為：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，黃豆粉3-5g/L，酵母 浸膏6-9g/L，葡萄糖18-22g/L，麥芽浸膏25-30g，硫酸銨0? 5-0. 7g/L，硫酸鎂0? 3-0. 4g/ L，磷酸二氧鉀1.8-2. 3g/L，碳酸鈣0.7g/L，硫酸亞鐵0.18g/L，硫酸錳0.025g/L;pH 5. 3〇
[0018] 濕黑霉菌細(xì)胞制備過(guò)程如下：黑霉菌ATCC 34956經(jīng)斜面、搖瓶培養(yǎng)，得到種子 液。1L發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液；發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至26-27°C， 將黑霉菌種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為接種比例為10-11%，通氣比為0.9-1V/ (V分 鐘)，26-27°C培養(yǎng)35-40小時(shí)，用過(guò)濾式離心機(jī)離心得到濕黑霉菌細(xì)胞，用作生物催化反應(yīng) 催化劑。
[0019] 生物催化轉(zhuǎn)化：0. 5L底部通氣攪拌反應(yīng)器中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6. 1，加入 底物4-乙?；?lián)苯，使其濃度為80g/L，玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為19g/L，山梨坦單月 桂酸酯7g/L，木糖24g/L、異丙醇5%V/V(體積濃度），121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻至32°C 時(shí)，加入濕黑霉菌細(xì)胞使其濃度為61g/L，通氣比為0. 12V/(V分鐘)，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反 應(yīng)時(shí)間為56小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，濾出細(xì)胞，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn) 物（S)-l_(聯(lián)苯-4-基）乙醇，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率99%，產(chǎn)品收率97%，對(duì)映體過(guò)量率98.5%。
[0020] 實(shí)施例2 種子培養(yǎng)基成份為：玉米漿（以干物質(zhì)計(jì)）含量為35-45g/L，酵母提取物10 g/L，葡 萄糖20 g/L，硫酸銨0. 5-0. 7g/L，硫酸鎂0. 3-0. 4g/L，磷酸二氧鉀1. 8-2. 3g/L;配制固體 培養(yǎng)基時(shí)添加15g/L的瓊脂粉。
[0021] 培養(yǎng)液成份為：