循環(huán)腫瘤細(xì)胞代謝活動(dòng)檢測(cè)方法和裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物與醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及人外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞代謝活動(dòng)的檢測(cè)方法和裝置。本發(fā)明方法和裝置可對(duì)人外周血中捕獲到的CTC進(jìn)行代謝功能分型，并用于預(yù)測(cè)這些CTC的惡性程度。
【背景技術(shù)】
[0002]人外周血中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating Tumor Cell, CTC)是指從腫瘤病灶播散進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，并在一定條件下可發(fā)展為腫瘤轉(zhuǎn)移性病灶。由于超過(guò)90%的癌癥死亡是由轉(zhuǎn)移造成的，而CTC是腫瘤轉(zhuǎn)移的直接來(lái)源，因此從血液中分離CTC并對(duì)其進(jìn)行分子檢測(cè)越來(lái)越引起人們的重視。
[0003]目前對(duì)CTC的檢測(cè)主要是對(duì)癌癥患者外周血中的全體CTC進(jìn)行計(jì)數(shù)，最具代表性的技術(shù)是目前唯一獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)的CellSearch系統(tǒng)，它被批準(zhǔn)用于檢測(cè)轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌及結(jié)直腸癌患者外周血中CTC的。這一系統(tǒng)運(yùn)用標(biāo)記有針對(duì)EpCAM抗體的磁性顆粒對(duì)癌癥患者7.5毫升血液中CTC進(jìn)行捕獲，然后通過(guò)細(xì)胞固定、透膜、以及三重的免疫熒光染色(DAP1、CK、⑶45)，將DAPI+/CK+/⑶45-且符合一定形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞定義為CTC并計(jì)數(shù)。臨床試驗(yàn)(Cristofanilli M, Budd T, Ellis MJ, etal.N.Engl.J.Med.2004, 351, 781-791 ；Riethdorf S, Fritsche H, Muller V, et al.Clin.Cancer Res.2007, 13, 920-928 ；Cohen SJ，Punt CJAj Iannotti N，et al.J.Cl in.0ncol.2008，26，3213-3221)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌患者7.5毫升血液中檢測(cè)到5個(gè)及以上的CTC預(yù)后較差，反之則預(yù)后較好，因此美國(guó)FDA在2004、2007與2008年分別批準(zhǔn)CellSearch系統(tǒng)用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、結(jié)直腸癌與前列腺癌的預(yù)后評(píng)估、無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期的預(yù)測(cè)，我國(guó)國(guó)家食品藥品管理局在2012年8月批準(zhǔn)CellSearch系統(tǒng)用于乳腺癌的預(yù)后評(píng)估。
[0004]然而，僅對(duì)全體CTC進(jìn)行計(jì)數(shù)無(wú)法全面準(zhǔn)確的反映腫瘤病灶當(dāng)前的狀態(tài)以及轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，其原因在于研究發(fā)現(xiàn)CTC具有很大的功能異質(zhì)性，相當(dāng)一部分CTC處于凋亡狀態(tài)，只有很小一部分CTC能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)移，這與臨床上觀(guān)察到的是一致的，因此臨床上需要真正關(guān)注的是那一小部分具有高度活力與轉(zhuǎn)移潛能的CTC。目前已有研究以活CTC (通過(guò)活細(xì)胞染料或分泌蛋白來(lái)確定細(xì)胞活性)數(shù)目或者活CTC占總CTC的比例為標(biāo)志物進(jìn)行臨床研究探索CTC的應(yīng)用領(lǐng)域，但細(xì)胞活性本身仍然與腫瘤細(xì)胞的惡性程度相關(guān)性較低，目前尚缺乏對(duì)CTC功能進(jìn)行檢測(cè)以確定CTC惡性程度與轉(zhuǎn)移可能性的技術(shù)與設(shè)備。
[0005]因此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)能夠有效、快速地檢測(cè)具有高度活性與惡性程度的CTC的技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的就是提供一種有效、快速地檢測(cè)腫瘤患者血液中游離的CTC的惡性程度的方法以及檢測(cè)設(shè)備。
[0007]在本發(fā)明的第一方面，提供了一種非診斷性地檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞代謝活動(dòng)的方法，包括步驟:
[0008](a)從外周血樣品中富集分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC，從而得到分離到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞 CTC ;
[0009](b)將上一步驟分離到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞，置于微孔陣列芯片中，從而使得所述微孔陣列芯片的各個(gè)微孔中至多具有一個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞；
[0010](C)對(duì)上一步驟中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇處理，從而獲得經(jīng)復(fù)蘇處理的循環(huán)腫瘤細(xì)胞；
[0011](d)在帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的葡萄糖類(lèi)似物存在下，培養(yǎng)所述的經(jīng)復(fù)蘇處理的循環(huán)腫瘤細(xì)胞；和
[0012](e)檢測(cè)所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞對(duì)所述帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的葡萄糖類(lèi)似物的攝取情況，從而定性或定量地確定所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞代謝活動(dòng)和/或惡性程度。
[0013]在另一優(yōu)選例中，對(duì)所述葡萄糖類(lèi)似物的攝取量高，就表示該循環(huán)腫瘤細(xì)胞的惡性程度高。
[0014]在另一優(yōu)選例中，在步驟(C)和(d)之間，還包括步驟:對(duì)經(jīng)復(fù)蘇處理的循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行饑餓處理。
[0015]在另一優(yōu)選例中，步驟(C)中，在復(fù)蘇處理中，還包括加入針對(duì)白細(xì)胞表面抗原的熒光修飾抗體(如ant1-CD45-FITC)以識(shí)別白細(xì)胞，從而將CTC與白細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。
[0016]在另一優(yōu)選例中，步驟(C)中，在復(fù)蘇處理中，還包括加入牛血清白蛋白對(duì)細(xì)胞、微孔芯片進(jìn)行封閉，消除對(duì)2-NBDG的非特異性吸附。
[0017]在另一優(yōu)選例中，步驟(C)中，在復(fù)蘇處理中，加入死細(xì)胞染料(如EthD-1，ethdium homodimer-1)，從而識(shí)別出死細(xì)胞。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述的饑餓處理是將所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞置于低葡萄糖濃度或無(wú)葡萄糖的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)一段時(shí)間。
[0019]在另一優(yōu)選例中，該饑餓處理的培養(yǎng)時(shí)間為1-60分鐘，較佳地為2-30分鐘，更佳地為5-20分鐘。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述的復(fù)蘇處理包括選自下組的一種或多種:
[0021](i)物理環(huán)境復(fù)蘇，其中所述物理環(huán)境復(fù)蘇是指低氧環(huán)境，即氧氣體積分?jǐn)?shù)低于10% ；
[0022](ii)化學(xué)環(huán)境復(fù)蘇，其中所述化學(xué)環(huán)境是指在含有細(xì)胞因子的細(xì)胞培養(yǎng)液下培養(yǎng)，其中所述的細(xì)胞因子包括表皮生長(zhǎng)因子、纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子或其組合；
[0023](iii)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液復(fù)蘇。
[0024]在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測(cè)標(biāo)記物包括化學(xué)修飾基團(tuán)。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測(cè)標(biāo)記物包括熒光基團(tuán)、生物素。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的葡萄糖類(lèi)似物為2-NBDG。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述的外周血樣品為來(lái)自哺乳動(dòng)物(如人)的樣品。
[0028]在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，從外周血中富集分離循環(huán)腫瘤細(xì)胞是通過(guò)免疫磁珠法進(jìn)行分離，其中免疫磁珠上負(fù)載有與腫瘤表面抗原特異性結(jié)合的抗體。
[0029]在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，通過(guò)魚(yú)骨形芯片分離捕獲法進(jìn)行分離。
[0030]在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，使用圖4所示結(jié)構(gòu)的魚(yú)骨形芯片進(jìn)行分離。
[0031]在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中從外周血樣品中富集分離到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC的數(shù)量為nl ;而在步驟(b)中，所述微孔陣列芯片的微孔數(shù)量為n2，并且n2/nl的比值彡10。
[0032]在另一優(yōu)選例中，n2/nl的比值彡20，更佳地n2/nl的比值彡100。
[0033]在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)中，將步驟(a)獲得的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的懸浮液加到所述微孔陣列芯片，并施加磁場(chǎng)使所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入微孔，從而保證葡萄糖攝取檢測(cè)試驗(yàn)樣本不丟失。
[0034]在另一優(yōu)選例中，在步驟(e)中，先清洗去多余的所述葡萄糖類(lèi)似物，然后根據(jù)被攝取進(jìn)入循環(huán)腫瘤細(xì)胞的所述葡萄糖類(lèi)似物的信號(hào)，表征該循環(huán)腫瘤細(xì)胞攝取葡萄糖的能力。
[0035]在另一優(yōu)選例中，在所述清洗去多余的所述葡萄糖類(lèi)似物的過(guò)程中，是在施加磁場(chǎng)的情況下進(jìn)行，從而確保循環(huán)腫瘤細(xì)胞被固定在基底上從而不被洗脫。
[0036]在另一優(yōu)選例中，在步驟(b)至(e)中，所述的循環(huán)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面結(jié)合有磁珠。
[0037]在另一優(yōu)選例中，在另一優(yōu)選例中，所述的分離到的循環(huán)腫瘤細(xì)胞CTC的表面結(jié)合有免疫磁珠。
[0038]在另一優(yōu)選例中，在步驟(d)中，所述葡萄糖類(lèi)似物與循環(huán)腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的時(shí)間為2分鐘至2小時(shí)，更佳地為5分鐘至I小時(shí)。
[0039]在另一優(yōu)選例中，在步驟(e)中，對(duì)攝取進(jìn)入循環(huán)腫瘤細(xì)胞的葡萄糖類(lèi)似物量的檢測(cè)通過(guò)熒光信號(hào)或光譜信號(hào)。
[0040]在另一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，所述的外周血樣品是(i)未經(jīng)任何處理的外周血樣品；或(ii)未經(jīng)去除紅細(xì)胞處理和/或未經(jīng)去除白細(xì)胞處理的外周血樣品。
[0041]在另一優(yōu)選例中，所述的外周血樣品是經(jīng)低速離心去除血小板和血漿的外周血樣品O
[0042]在另一優(yōu)選例中，在步驟(e)中，還包括:與參考值或標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行比較，從而定性或定量地確定所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞代謝活動(dòng)水平。
[0043]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測(cè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞代謝活動(dòng)的裝置，所述裝置包括:
[0044](a)魚(yú)骨形芯片；
[0045](b)微孔陣列芯片；
[0046](c)第一容器，以及置于所述第一容器中的帶有可檢測(cè)標(biāo)記物的葡萄糖類(lèi)似物；
[0047](d)任選的用于捕獲循環(huán)腫瘤細(xì)胞的磁珠，所述磁珠上負(fù)載有與腫瘤表面抗原特異性結(jié)合的抗體；和
[0048](e)任選的磁場(chǎng)裝置，所述磁場(chǎng)裝置包括永久磁鐵或電磁鐵。
[0049]在另一優(yōu)選例中，所述的裝置還包括:
[0050](f)第二容器，以及位于所述第二容器內(nèi)的封閉劑(如牛血清白蛋白)。
[0051]在另一優(yōu)選例中，所述的裝置還包括:
[0052](g)第三容器，以及位于所述第三容器內(nèi)的用于區(qū)分循環(huán)腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞的抗體，例如針對(duì)白細(xì)胞表面抗原的熒光修飾抗體(如ant1-CD45-FITC)。
[0053]在另一優(yōu)選例中，所述的裝置還包括:
[0054](h)第四容器，以及位于所述第四容器內(nèi)的用于識(shí)別死細(xì)胞的死細(xì)胞染料(如EthD-1，ethdium homodimer-1)。
[0055]在另一優(yōu)