用于鑒定施氏鱘種質(zhì)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及魚類種質(zhì)的鑒定方法，具體涉及一種用于鑒定施氏舞種質(zhì)的分子標(biāo)記 及利用該分子標(biāo)記鑒定施氏舞種質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 舞形目魚類是地球現(xiàn)存最古老的魚類之一，有"活化石"之稱。施氏舞（Acipenser dabryanus)屬舞形目、舞科、舞屬，俗名七粒浮子等，主要分布于黑龍江水系，自下游至上游 額爾古納河及石勒喀河等；多數(shù)分布于黑龍江中游和松花江下游，烏蘇里江較少。由于過度 捕撈和水體污染等原因，施氏舞的資源量已經(jīng)急劇減少。施氏舞2010年被世界自然與資源 保護(hù)耳關(guān)盟（International Union for Conservation of Nature and Natural Resources 簡(jiǎn)稱IUCN)紅色名錄列為極度瀕j危（Critically Endangered, CR)物種，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià) 值和科研價(jià)值。
[0003] 目前對(duì)于舞形目魚類的鑒定主要采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方法，由于形態(tài)學(xué)不 適用于魚子醬等舞魚產(chǎn)品的鑒定，通常采用線粒體上的分子標(biāo)記鑒定舞魚及其產(chǎn)品。如 Boscari 等(Boscari, E.,et al. , Species and hybrid identification of sturgeon caviar:a new molecular approach to detect illegal trade. Molecular ecology resources,14(3):489-498.May 2014D0I:10. 1111/1755-0998. 12203ISSN 1755-098X)采 用線粒體D-l〇〇p和S7對(duì)施氏舞進(jìn)行了鑒定，對(duì)施氏舞的鑒定準(zhǔn)確性不高，操作繁瑣。中國 專利申請(qǐng)?zhí)?00510010346.0,名稱為"一種鑒定史氏舞、達(dá)氏鰉的技術(shù)"的發(fā)明專利，它是在 施氏舞、達(dá)氏鰉及其產(chǎn)品DNA檢測(cè)中使用具有種屬特異性的DNA分子標(biāo)記AHN，AHN引物大 小為10bp，堿基序列為cacccggatg。用此引物對(duì)施氏舞、達(dá)氏|皇及其產(chǎn)品DNA進(jìn)行PCR檢 測(cè)，施氏舞可獲得200bp電泳帶，達(dá)氏鰉則無此帶，達(dá)到對(duì)兩種魚及其產(chǎn)品進(jìn)行鑒定、標(biāo)識(shí) 的目的。該專利方法僅能在一定程度上鑒定出施氏舞，區(qū)分施氏舞與達(dá)烏爾鰉，僅適用于已 知為施氏舞或達(dá)烏爾鰉的疑似樣本，因此適用范圍較窄。因此，亟待開發(fā)出能夠簡(jiǎn)便快速、 準(zhǔn)確檢測(cè)施氏舞與其他舞魚的分子鑒定技術(shù)，用于放流等種質(zhì)鑒定和市場(chǎng)監(jiān)管等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了鑒定施氏舞及其產(chǎn)品，從分子生物學(xué)層面上將形態(tài)上不易區(qū)分的施氏 舞或其產(chǎn)品進(jìn)行鑒定，提供了一種用于鑒定施氏舞種質(zhì)的分子標(biāo)記及利用該分子標(biāo)記鑒定 施氏舞種質(zhì)的方法。本發(fā)明在舞科魚類中篩選核基因片段作為分子標(biāo)記，應(yīng)用核基因片段 SNP位點(diǎn)，成功鑒定了施氏舞，同樣適用于施氏舞產(chǎn)品的鑒定。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：
[0006] -方面，本發(fā)明涉及一種用于鑒定施氏舞種質(zhì)的分子標(biāo)記，其為以待測(cè)舞科魚類 基因組DNA為模板，通過特異性引物PCR擴(kuò)增獲得的fzd8基因片段，所述特異性引物的核 苷酸序列為：
[0007]正向引物：5'-TAACCACGACACACAGGATG-3'（SEQ IDN0:8)，
[0008] 反向引物：5' -CTGAATAAAGACACGAACCC-3'（SEQ ID N0:9);
[0009] 上述擴(kuò)增獲得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位為C或T。
[0010] 另一方面，本發(fā)明涉及fzd8基因片段的特異性引物，其核苷酸序列為：
[0011] 正向引物：5'-TAACCACGACACACAGGATG-3'（SEQ ID N0:8);
[0012] 反向引物：5'-CTGAATAAAGACACGAACCC-3'（SEQ ID N0:9)。
[0013] 另一方面，本發(fā)明涉及一種鑒定施氏舞種質(zhì)的方法，其特征在于：
[0014] (1)從待測(cè)舞科魚類樣本中提取基因組DNA ;
[0015] (2)以待測(cè)舞科魚類基因組DNA為模板，利用所述fzd8基因片段的特異性引物 PCR擴(kuò)增fzd8基因片段；
[0016] (3)檢測(cè)擴(kuò)增獲得的fzd8基因片段并測(cè)序，經(jīng)序列比對(duì)直接鑒定；
[0017] 其中擴(kuò)增獲得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位為C時(shí)，樣本為施氏舞或 其產(chǎn)品；擴(kuò)增獲得的fzd8基因片段的核苷酸序列中第299位為T時(shí)，樣本為其他舞魚或其 產(chǎn)品。
[0018] 本發(fā)明所述的舞科魚類包括施氏舞、達(dá)氏舞、中華舞、俄羅斯舞、西伯利亞舞、小體 舞和達(dá)烏爾鰉中的任意一種或者多種。
[0019] 所述的施氏舞產(chǎn)品或其他舞魚產(chǎn)品包括魚子醬、熏制品、罐頭和/或皮制品等。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明，SNP(single nucleotide polymorphism，SNP)是單個(gè)核酸差異的分 子標(biāo)記技術(shù)，在物種鑒定領(lǐng)域，方法是依據(jù)同一個(gè)目的基因序列在近緣物種間的單個(gè)堿基 的差異，進(jìn)而用于研究種群遺傳變異和物種鑒定。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，fzd8是卷曲蛋白基因片段，利用fzd8上含有的單核苷酸多態(tài)性 (SNP)位點(diǎn)，用于施氏舞的種質(zhì)鑒定，具有實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確快捷，操作簡(jiǎn)便，適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。
[0022] 本發(fā)明以施氏舞、達(dá)氏舞、中華舞、俄羅斯舞、西伯利亞舞、小體舞和達(dá)烏爾鰉樣本 中提取的基因組DNA為模板，用本發(fā)明所述fzd8基因片段的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 得到的fzd8基因片段為707bp，其核苷酸序列分別為SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6 和 SEQ ID NO:7。
[0023] 上述fzd8基因片段經(jīng)序列比對(duì)后，確定fzd8基因片段的核苷酸序列的第299位 點(diǎn)的堿基是C的樣本來源于施氏舞，其他舞科魚類樣本來源的fzd8基因片段的第299位 為T。即通過鑒定本發(fā)明所述特異性引物擴(kuò)增出的fzd8基因片段中第299位的堿基是否為 C，可鑒定施氏舞或其產(chǎn)品。
[0024] 本發(fā)明的有益效果表現(xiàn)為：
[0025] 1、本發(fā)明采用核基因DNA序列作為分子標(biāo)記，相較于線粒體基因，可以更準(zhǔn)確快 速地將形態(tài)上不易區(qū)分的施氏舞或其產(chǎn)品鑒定出來。采用fzd8基因片段上SNP位點(diǎn)分析 鑒定，具有實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確，鑒定可靠快捷，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。
[0026] 2、本發(fā)明在舞科魚類中篩選設(shè)計(jì)了 fzd8基因片段作為分子標(biāo)記，應(yīng)用fzd8基因 片段的SNP位點(diǎn)，能把施氏舞或其產(chǎn)品從達(dá)氏舞、中華舞、俄羅斯舞、西伯利亞舞、小體舞及 達(dá)烏爾鰉中鑒定出來。具有適用的待檢測(cè)樣本來源更廣，準(zhǔn)確性高，實(shí)驗(yàn)快捷，操作簡(jiǎn)便，結(jié) 果準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
[0028] 本發(fā)明使用的主要儀器如下：
[0029] PCR 儀：Bio-Rad iCycler 和MJ100
[0030]離心機(jī)：Eppendorf Centrifuge 5415