一種鑒定或輔助鑒定馬鈴薯薯形的方法及其專用的引物對的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種鑒定或輔助鑒定馬鈴薯薯形的方法及其 專用的引物對。
【背景技術】
[0002] 馬鈴薯是世界第三大、我國第四大糧食作物，因其具有耐寒、耐貧瘠、高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)、適 應性廣、營養(yǎng)全面等優(yōu)點，在世界范圍內廣泛種植，對于保障我國及世界的糧食安全具有重 要意義。塊莖形狀即薯形是馬鈴薯的重要農藝性狀之一，也是鑒別品種特征的重要依據(jù)之 一。不同的消費習慣和加工產(chǎn)品對薯形的要求不同，如東北地區(qū)消費者偏好圓薯形品種，而 中原和南方地區(qū)消費者偏好長薯形品種；一般炸條要求長薯形品種，而炸片需要圓薯形品 種。因此，選育特定薯形的品種滿足不同消費者和加工需求，對于促進馬鈴薯產(chǎn)業(yè)全面發(fā)展 具有重要意義。
[0003] 傳統(tǒng)育種主要依賴于表型選擇?？墒黔h(huán)境條件、基因型、基因環(huán)境互作等多種因素 會影響表型選擇的準確性。培育一個優(yōu)良品種往往需要七、八年甚至十幾年時間。分子標 記輔助選擇技術可大大提高選擇準確性和育種效率，從而加速馬鈴薯育種進程。而獲得易 于操作且與特定性狀緊密連鎖的分子標記是進行標記輔助選擇的前提。馬鈴薯栽培品種是 高度雜合的四倍體（2n = 4x = 48)作物，遺傳背景狹窄、染色體高度雜合、遺傳重組頻率高 且存在嚴重的自交衰退現(xiàn)象，開發(fā)分子標記困難。而自然界中絕大多數(shù)馬鈴薯以二倍體形 式存在，相對于四倍體，二倍體染色體數(shù)目較少，遺傳背景相對簡單，易于進行遺傳分析和 操作。同時，馬鈴薯單倍型基因組序列框架圖已經(jīng)完成，覆蓋了馬鈴薯95%以上的基因，為 馬鈴薯分子標記的開發(fā)提供了資源?；谏鲜鲴R鈴薯遺傳特性，研究者大多利用二倍體材 料開發(fā)標記，再將開發(fā)的標記應用到四倍體材料中。但是，在將二倍體中開發(fā)的標記應用到 四倍體材料過程中也會出現(xiàn)一些問題，由于四倍體馬鈴薯在減數(shù)分裂過程中，有四條同源 染色體發(fā)生配對，而且高度異質的遠緣雜種常導致在一個遺傳位點存在多種等位基因組合 形式，致使染色體發(fā)生交換重組而出現(xiàn)標記與性狀偏分離、篩選準確率低等問題。因此，二 倍體材料中開發(fā)的標記應用到四倍體材料中并不十分順利。
[0004] 到目前為止，已有幾十個馬鈴薯性狀被標記，如包括抗晚疫病、抗青枯病、抗病毒 病等的抗性性狀，包括炸片顏色、塊莖休眠、薯肉顏色等的品質性狀以及耐旱性、耐凍性等 的抗逆性狀。但目前可用于馬鈴薯薯形育種的標記很少，可用于四倍體馬鈴薯薯形育種的 標記更少，且目前所開發(fā)的薯形標記在應用于薯形篩選時，準確性和穩(wěn)定性較差，篩選效率 低，實際應用效果差。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測馬鈴薯薯形的方法。
[0006] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測馬鈴薯薯形的方法包括如下步驟：檢測待測馬 鈴薯的同源染色體上的目標基因的第805位脫氧核糖核苷酸是否為C、第896位脫氧核糖核 苷酸是否為T和第1146位脫氧核糖核苷酸是否為A :
[0007] 1)若待測馬鈴薯的至少一條同源染色體上的目標基因的第805位脫氧核糖核苷 酸為C，且所述待測馬鈴薯的至少一條同源染色體上的目標基因的第896位脫氧核糖核苷 酸為T，且所述待測馬鈴薯的至少一條同源染色體上的目標基因的第1146位脫氧核糖核苷 酸為A，則待測馬鈴薯為或候選為圓薯形馬鈴薯；
[0008] 2)若待測馬鈴薯的同源染色體上的目標基因不滿足上述條件，則待測馬鈴薯為或 候選為長薯形馬鈴薯；
[0009] 所述目標基因的序列如序列表中序列3所示。
[0010] 上述方法中，所述檢測待測馬鈴薯的同源染色體上的目標基因的第805位脫氧核 糖核苷酸是否為C、第896位脫氧核糖核苷酸是否為T和第1146位脫氧核糖核苷酸是否為 A的方法為直接測序。
[0011] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測馬鈴薯薯形的引物對。
[0012] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測馬鈴薯薯形的引物對由序列表中序列1所示 的DNA分子和序列表中序列2所不的DNA分子組成。
[0013] 本發(fā)明的第三個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測馬鈴薯薯形的PCR試劑。
[0014] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測馬鈴薯薯形的的PCR試劑包括上述引物對。
[0015] 本發(fā)明的第四個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測馬鈴薯薯形的試劑盒。
[0016] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測馬鈴薯薯形的試劑盒包括上述引物對或上述 PCR試劑。
[0017] 本發(fā)明的第五個目的是提供上述引物對或上述PCR試劑或上述試劑盒的新用途。
[0018] 本發(fā)明提供了上述引物對或上述PCR試劑或上述試劑盒在鑒定或輔助鑒定待測 馬鈴薯為圓薯形馬鈴薯還是長薯形馬鈴薯中的應用。
[0019] 本發(fā)明還提供了上述引物對或上述PCR試劑或上述試劑盒在選育或輔助選育圓 薯形馬鈴薯和/或長薯形馬鈴薯中的應用。
[0020] 本發(fā)明的最后一個目的是提供一種鑒定或輔助鑒定待測馬鈴薯為圓薯形馬鈴薯 還是長薯形馬鈴薯的方法。
[0021] 本發(fā)明提供的鑒定或輔助鑒定待測馬鈴薯為圓薯形馬鈴薯還是長薯形馬鈴薯的 方法包括如下步驟：
[0022] (1)用上述引物對對待測馬鈴薯進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物；
[0023] (2)用Afl II內切酶對所述PCR擴增產(chǎn)物進行酶切，得到酶切產(chǎn)物；
[0024] (3)檢測所述酶切產(chǎn)物的大小；
[0025] 若酶切產(chǎn)物含有大小為700bp和200bp的片段；則待測馬鈴薯為或候選為圓薯形 馬鈴薯；
[0026] 若酶切產(chǎn)物僅含有大小為900bp的片段；則待測馬鈴薯為或候選為長薯形馬鈴 薯。
[0027] 上述方法中，所述PCR擴增的模板為待測馬鈴薯的基因組DNA ;所述PCR擴增的退 火溫度為60 °C。
[0028] 上述方法或上述引物對或上述PCR試劑或上述試劑盒或上述應用中，所述圓薯形 馬鈴薯為塊莖的最大縱軸的長度與最大橫軸的長度的比值I < 1. 4的馬鈴薯；所述長薯形 馬鈴薯為塊莖的最大縱軸的長度與最大橫軸的長度的比值I多1. 4的馬鈴薯；
[0029] 所述縱軸為匍匐莖生長方向；
[0030] 所述橫軸為垂直于匍匐莖生長方向。
[0031] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0032] 1)彌補目前馬鈴薯薯形標記不足及表觀選擇準確性差、篩選效率低、工作量大的 問題。
[0033] 2)利用本發(fā)明開發(fā)的標記，在苗期就可以根據(jù)馬鈴薯的DNA進行鑒定，從而確定 其薯形，可節(jié)省人力物力，縮短育種周期。
[0034] 本發(fā)明以馬鈴薯二倍體材料，基于馬鈴薯基因組相關序列信息，結合分離群體分 組分析法（BSA)提供了一種鑒定或輔助鑒定馬鈴薯薯形的方法并開發(fā)了一個可用于馬鈴 薯薯形輔助選擇的分子標記1137-CAPSVI，可對馬鈴薯塊莖形狀進行準確、方便、快速的篩 選。通過實驗證明：利用分子標記1137-CAPSVI對四倍體薯形材料進行檢測，檢測結果與表 型鑒定結果的吻合度達80%以上，其中對圓薯形的吻合度達90 %以上，選擇準確率高，穩(wěn) 定性好，而且在苗期就能對后代進行選擇，不受植物生長階段及環(huán)境條件影響，可有效加速 馬鈴薯薯形育種進程，降低育種成本。
【附圖說明】
[0035] 圖1為部分試驗材料的基因組DNA的電泳檢測。
[0036] 圖2為PCR產(chǎn)物經(jīng)Aflll酶切后的電泳圖。其中，M:Marker ;P1 :320-02 ;P2 : 10618-01 ;RB :圓形混池；LB :長形混池。
[0037] 圖3為四倍體材料薯形鑒定結果頻率分布圖。
【具體實施方式】
[0038] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0039] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0040] 下述實施例中的長薯形親本材料10618-01和圓薯形親本材料320-02均在文獻 "Zhang Yong-fei，Genetic analysis of pigmented tuber FLesh in potato, 2009'，中公 開過，公眾可從中國農業(yè)科學研究院蔬菜花卉研究所獲得。
[0041] 下述實施例中的LB固體培養(yǎng)基的配方（1L):胰蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 10g、 瓊脂15g，加入蒸餾