23] TTI-621 :利用引物P#5863和P#1737進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94°C持續(xù)1分 鐘并且52°C持續(xù)3分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94°C持續(xù)1分鐘、52°C持續(xù)2分 鐘以及63 °C持續(xù)4分鐘。
[0124] TTI-622 :利用引物P#5863和P#2058進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94°C持續(xù)1分 鐘并且60°C持續(xù)3分鐘，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)為94°C持續(xù)1分鐘、52°C持續(xù)2分 鐘以及63 °C持續(xù)4分鐘。
[0125]然后將反應(yīng)在68-72°C保持7-8分鐘，冷卻至4°C。通過1-1. 4%瓊脂糖凝膠將反 應(yīng)產(chǎn)物分離，并用溴化乙錠使其可視，并根據(jù)如下方式連接入PMPG表達(dá)載體（加拿大蒙特 利爾市的生物技術(shù)研究所）：利用QIAquick凝膠提取試劑盒（Qiagen公司），從瓊脂糖凝膠 中切割并純化經(jīng)PCR擴(kuò)增的目的DNA條帶。用Nhel和BamHI限制性內(nèi)切酶（New England BioLabs公司）對(duì)經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，并利用Qiaquick凝膠純化試劑盒（Qiagen 公司）從凝膠中進(jìn)行純化。然后用T4DNA連接酶（Invitrogen公司）將該片段連接入已 經(jīng)相似地經(jīng)Nhel和BamHI酶酶切的pMPG表達(dá)質(zhì)粒。該pMPG質(zhì)粒使用CMV啟動(dòng)子和TK Poly A終止子，并且含有潮霉素抗性選擇標(biāo)記。然后根據(jù)制造商的說(shuō)明書，用2 yl的連接 產(chǎn)物轉(zhuǎn)化25 y 1的感受態(tài)E. coli DH5 a細(xì)胞（Invitrogen公司）。將轉(zhuǎn)化細(xì)胞散布在含有 100 y g/ml氨芐青霉素（Sigma公司）的LB瓊脂平板上，然后在37°C下孵育20小時(shí)。利用 QIAprep Spin mini-prep試劑盒（Qiagen公司）從小規(guī)模的E. coli培養(yǎng)物中提取并純化 質(zhì)粒DNA，并利用焚光染料綴合的 ddNTPs(Core Molecular Biology Facility, York大學(xué)） 通過自動(dòng)測(cè)序來(lái)鑒定DNA序列。為了轉(zhuǎn)染，利用EndoFree Plasmid Maxi試劑盒（Qiagen 公司）制備大量的質(zhì)粒DNA，然后利用熒光染料綴合的ddNTPs(C〇re Molecular Biology Facility, York大學(xué)）通過自動(dòng)測(cè)序再次鑒定序列。
[0126] 細(xì)胞系的制備
[0127] 利用CH0-S細(xì)胞系（Invitrogen公司）產(chǎn)生穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。簡(jiǎn)言之，用Xbal (New England BioLabs公司）將分離的質(zhì)粒DNA線性化，并用QIAGEN柱（Qiagen公司）純化。 CH0-S細(xì)胞在補(bǔ)充有8mM L-谷氨酰胺和lxHT-補(bǔ)充物的不含血清的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基 (CD-CH0, Invitrogen 公司）中生長(zhǎng)，利用 Lipofectamine 2000 試劑（Invitrogen 公司）用 線性化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染該細(xì)胞。48小時(shí)后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到96孔板中，以在含有600 y g/mL潮霉 素B(Invitrogen公司）的培養(yǎng)基中的不同濃度（10000、5000或2000個(gè)細(xì)胞/孔）接種。 空白轉(zhuǎn)染對(duì)照在相同的方式下進(jìn)行，但是未向混合物中加入DNA。轉(zhuǎn)染2-3周后，挑取一組 抗藥性寡克隆，根據(jù)如下方法利用ELISA對(duì)經(jīng)48h表達(dá)研究的上清進(jìn)行篩選：用0. 1 y g/孔 的捕獲Ab (羊抗人IgGFc)包被96孔板，并在4°C下孵育過夜。洗滌所述孔，并用200 y 1的 含有2% BSA的PBST在室溫下封閉所述孔1小時(shí)。洗滌后，100 y 1樣品用含有1% BSA的 PBST稀釋，加入孔中，孵育1小時(shí)，洗滌，然后在室溫下用HRP偶聯(lián)的檢測(cè)Ab (HRP偶聯(lián)的羊 抗人IgGFc)孵育1小時(shí)。然后洗滌所述孔，并加入TMB底物（Moss公司），在室溫下孵育3 至5分鐘。利用iMark微板閱讀器（Biorad)在450nm/655nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，并利用已 知量的純化融合蛋白構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。在含有600 y g/mL潮霉素B的完全CD-CH0培養(yǎng)基中， 以更低的細(xì)胞濃度（〇. 1、〇. 25和0. 5個(gè)細(xì)胞/孔）對(duì)3個(gè)表達(dá)最高的寡克隆進(jìn)行第二次有 限稀釋。2-3周后，如上所述通過ELISA對(duì)抗藥克隆再次進(jìn)行產(chǎn)生重組蛋白的評(píng)價(jià)。生產(chǎn)率 以pg/細(xì)胞/天表示，對(duì)于人SIRP a融合蛋白，生產(chǎn)率在1. 4至23. 9pg/細(xì)胞/天的范圍 內(nèi)。用表達(dá)最高的單細(xì)胞克隆在WAVE生物反應(yīng)器系統(tǒng)中進(jìn)行上清液批量生產(chǎn)。在一些情 況中，在達(dá)到單克隆階段之前，利用最佳的寡克隆進(jìn)行生產(chǎn)。
[0128] 蛋白質(zhì)純化
[0129] 為了快速生產(chǎn)小批量蛋白質(zhì)，在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的293F細(xì)胞中制備一些SIRPa -Fc批 次。簡(jiǎn)言之，在293F培養(yǎng)基（Invitrogen公司）中培養(yǎng)FreeStyle 293F細(xì)胞（Invitrogen 公司），該細(xì)胞用非線性的質(zhì)粒DNA和293Fectin試劑（Invitrogen公司）轉(zhuǎn)染，并以 80-100mL/瓶的體積在37°C、5% 0)2下在搖瓶中使其生長(zhǎng)3至6天。每天監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度和 生活力直到細(xì)胞生活力降至90 %。成批收獲時(shí)細(xì)胞生活力在85-90 %的范圍內(nèi)。
[0130] 對(duì)于從CH0-S細(xì)胞中的純化，在WAVE -次性袋式生物反應(yīng)器系統(tǒng) Base20/50EHT(GE Healthcare公司）中由穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的高表達(dá)寡細(xì)胞克隆或單細(xì)胞克隆產(chǎn) 生5或10L培養(yǎng)上清。簡(jiǎn)言之，CHO-S轉(zhuǎn)染株在37°C下在完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基（補(bǔ)充了 8mM L-谷 氨酰胺、lxHT-補(bǔ)充物和600 y g/mL潮霉素B的⑶-CH0)中在靜態(tài)T150瓶中生長(zhǎng)，從而制 備足夠的細(xì)胞數(shù)以開始以〇. 5xl06個(gè)細(xì)胞/mL進(jìn)行的1L或2L的培養(yǎng)，從而分別進(jìn)行5L或 10L的試驗(yàn)。將細(xì)胞接種于生物反應(yīng)器袋，然后在37°C、10% 0)2下，以搖速15-20rpm、角 度7°、氣流0. 2-0. 4Lpm孵育。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到2至2. 5xl06個(gè)細(xì)胞/mL的密度（通常在接 種2-3天之內(nèi)）時(shí)，進(jìn)一步擴(kuò)大生物反應(yīng)器至5L或10L，并繼續(xù)在37°C、10% 0)2下，以搖 速15-20rpm、角度7°、氣流0. 2-0. 4Lpm下孵育。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到1至1. 5xl06個(gè)細(xì)胞/mL的 密度時(shí)，將溫度降至30°C，并且培養(yǎng)物進(jìn)一步在上述條件下繼續(xù)孵育7至10天。從第0天 開始，在30°C下，每?jī)商鞂?duì)培養(yǎng)物供應(yīng)1 % CH0生物反應(yīng)器供給補(bǔ)充物（feed bioreactor supplement) (Sigma公司），并且在細(xì)胞生活力降至約90 %時(shí)收獲培養(yǎng)物。收集上清液，在 4°C下以3000x g離心40分鐘，并在-20°C下冷凍直至純化。
[0131] 所有蛋白質(zhì)用兩步法純化，首先采用蛋白A層析。緩沖液置換的上清液用結(jié)合緩 沖液（20mM Na-P&3M NaCl，pH 7. 8)稀釋9倍，并在4°C下以2-3mL/分鐘的流速（根據(jù)上 樣體積和上樣時(shí)間確定）裝載入rProtein A柱（GE Healthcare公司）過夜。然后所述柱 用結(jié)合緩沖液洗滌（3mL/分鐘，20倍體積），并用0. 1M檸檬酸pH 4. 0和pH 2. 2以3mL/分 鐘洗脫蛋白質(zhì)。洗脫物質(zhì)以1M調(diào)節(jié)pH至中性，然后用HiTrap Phenyl HP色譜純化。簡(jiǎn)言 之，將蛋白質(zhì)稀釋至少4倍至0. 2M硫酸銨pH 7. 5,并以2-3mL/分鐘的流速（根據(jù)上樣體積 和上樣時(shí)間確定）裝載入HiTrap Phenyl HP柱（GE Healthcare公司）。收集流過組分中 的未聚集的SIRPaFc蛋白。采用利用BioMax 10膜（Millipore公司）的切向流過濾將蛋 白質(zhì)濃縮并緩沖液置換至PBS pH 7. 4中。用SDS-PAGE、利用羊抗IgGFc抗體和兔抗羊IgG HRP綴合物的蛋白質(zhì)印跡以及HPLC分析來(lái)確定各蛋白質(zhì)的品質(zhì)。利用N端測(cè)序和質(zhì)譜法鑒 定所有蛋白質(zhì)。
[0132] 1.比較單結(jié)構(gòu)域SIRP a Fc融合蛋白和3結(jié)構(gòu)域SIRP a Fc融合蛋白
[0133] SIRPa由3個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白（Ig)樣結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，然而與CD47的結(jié)合定位于 N端結(jié)構(gòu)域。為了確定SIRPaFc融合蛋白的最佳SIRPa區(qū)，我們制備了引入所有3個(gè)細(xì)胞 外SIRPa結(jié)構(gòu)域（TTI-602)或僅引入單一的N端結(jié)構(gòu)域（TTI-616)的蛋白質(zhì)。
[0134] 兩種蛋白都是在缺乏效應(yīng)子功能的突變的人IgG4Fc骨架上構(gòu)建的。我們使用直 接結(jié)合檢驗(yàn)（圖1A)和間接競(jìng)爭(zhēng)檢驗(yàn)（圖1B)比較了 TTI-602和TTI-616與人CD47的結(jié)合。 對(duì)于直接結(jié)合檢驗(yàn)，CD47+人Jurkat細(xì)胞分別與不同濃度（如所示出的）的hSIRP a Fc蛋 白在冰上孵育1小時(shí)。然后洗滌細(xì)胞以去除任何未結(jié)合的蛋白，然后將細(xì)胞與抗hlgG Fcg 特異性（Fab'）2FITC抗體在冰上孵育1小時(shí)。然后洗滌細(xì)胞，并通過與2%多聚甲醛溶液 過夜孵育來(lái)固定細(xì)胞。然后洗掉固定液，并且用流式細(xì)胞儀（BD FACScan)分析細(xì)胞。采用 非線性回歸將數(shù)據(jù)擬合為單一位點(diǎn)結(jié)合模型。對(duì)于間接檢驗(yàn)，將固定化的飽和量的生物素 化的人SIRP a Fc (TTI-601)單獨(dú)孵育，或與滴定量的TTI-602或TTI-616在冰上孵育15分 鐘。然后將該混合物加入人CD47+Jurkat細(xì)胞，在冰上孵育1小時(shí)，洗滌以除去未結(jié)合的蛋 白，然后與飽和量的鏈霉親和素PE在冰上在黑暗中孵育lh。然后洗滌細(xì)胞，如上所述固定 并用流式細(xì)胞儀分析。對(duì)幾何平均數(shù)進(jìn)行歸一化，其中100%抑制是單獨(dú)鏈霉親和素-PE的 幾何平均數(shù)，〇%抑制是單獨(dú)生物素化的TTI601的幾何平均數(shù)。通過非線性回歸分析，采用 S形劑量-反應(yīng)曲線擬合獲得最佳擬合線（Prism, Graphpad)。
[0135] 圖1A和1B中的數(shù)據(jù)清楚地示出TTI-602和TTI-616之間的結(jié)合差異，在兩個(gè)試驗(yàn) 中TTI-616具有更高的結(jié)合親和性。在直接結(jié)合檢驗(yàn)中，TTI-616的結(jié)合親和性比TTI-602 高10倍（EC 5。值：13. 4nm對(duì)139nm)。在間接結(jié)合檢驗(yàn)中，TTI-616的結(jié)合親和性是TTI-602 的7倍（EC5。值：4. 5nM對(duì)32. InM)。這些結(jié)果是出乎意料的，因?yàn)橹肮嫉臄?shù)據(jù)顯示， SIRP a的N端結(jié)構(gòu)域與包含所有三個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域的SIRP a具有相當(dāng)?shù)腃D47結(jié)合親和性 (Hatherley et al,2007J. Biol. Chem. 282:14567)〇
[0136] 2.設(shè)計(jì)具有不同F(xiàn)c區(qū)的人SIRP a Fc融合蛋白
[0137] 已經(jīng)確定了引入單個(gè)SIRPa結(jié)構(gòu)域的融合蛋白是優(yōu)選的，本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行研 究以確定最佳Fc區(qū)。制備了三種不同的人SIRPaFc融合蛋白，其含有相同的SIRPa區(qū) (31-148)，但是是在具有不同效應(yīng)子活性的不同F(xiàn)c成分的基礎(chǔ)上構(gòu)建的。設(shè)計(jì)細(xì)節(jié)總結(jié)在 下表2中。標(biāo)注的DNA和蛋白質(zhì)序列在附錄1中不出。
[0138] 表2 :人SIRP a Fc融合蛋白的設(shè)計(jì)。
[0139]
[0140] *對(duì)應(yīng)于EU編號(hào)系統(tǒng)的228位，旨在穩(wěn)定IgG4鉸鏈區(qū)域并防止導(dǎo)致形成單體的鏈 內(nèi)二硫鍵的形成（Angal et al，1993Mol. Immunol. 30:105);
[0141] **對(duì)應(yīng)于EU編號(hào)系統(tǒng)的233-236位，旨在進(jìn)一步降低Fc y受體結(jié)合（Armour et al,1999Eur. J. Immunol. 29:2613)〇
[0142] 3. SIRP a Fc融合蛋白與CD47的結(jié)合
[0143] 比較三種311^€^(：融合蛋白與細(xì)胞表面人0)47的結(jié)合。簡(jiǎn)言之，0)47+人11^1?^ 細(xì)胞分別與不同濃度（如所示出）的hSIRP a Fc蛋白在冰上孵育1小時(shí)。然后洗滌細(xì)胞去除 任何未結(jié)合的蛋白，然后將細(xì)胞與抗hlgG Fcg特異性（Fab'）2FITC抗體在冰上孵育1小時(shí)。 然后洗滌細(xì)胞，并通過與2%多聚甲醛溶液過夜孵育來(lái)固定細(xì)胞。然后洗掉固定液，并且用 流式細(xì)胞儀（BD FACScan)分析細(xì)胞。對(duì)幾何平均數(shù)進(jìn)行歸一化，并利用Prism(Graphpad) 通過非線性回歸將數(shù)據(jù)擬合為單一位點(diǎn)結(jié)合模型生成結(jié)合曲線和Kd值。
[0144] 如圖2所示，3種融合蛋白示出非常類似的結(jié)合曲線，產(chǎn)生幾乎相同的親和結(jié)合 (Kd)值（2.3-2. 4nM)。這是可以預(yù)期的，因?yàn)樗腥N蛋白均含有相同的SIRPa區(qū)，并且 預(yù)計(jì)Fc區(qū)不會(huì)影響配體結(jié)合。
[0145] 4. SIRP a Fc融合蛋白的體外促吞噬作用
[0146] 用SIRP a Fc阻斷⑶47增強(qiáng)了活化的人巨噬細(xì)胞對(duì)人急性髓細(xì)胞白血?。ˋML)月中 瘤細(xì)胞的吞噬作用。在體外比較3種融合蛋白的促吞噬活性從而確定Fc區(qū)是否影響AML 吞作用。首先利用磁性選擇（magnetic selection)，從Ficoll純化的人外周血單核的 細(xì)胞中分離CD14+單核細(xì)胞，由此得到人巨噬細(xì)胞。在含20ng/ml人單核細(xì)胞集落刺激因 子的X-vivo培養(yǎng)基中培養(yǎng)單核細(xì)胞至少1周以促進(jìn)其發(fā)育成巨噬細(xì)胞。然后將巨噬細(xì)胞 接種到24孔培養(yǎng)板中的玻片上，并與人干擾素Y過夜孵育。第二天，洗滌所述孔，并加入 LPS至少1小時(shí)。對(duì)人AML細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用CFSE標(biāo)記。標(biāo)記后，AML細(xì)胞在室溫下（RT)與 PBS、SIRP a Fc蛋白或同種型對(duì)照孵育15分鐘。然后將AML細(xì)胞添加到各孔中，混合，并在 37°C、5% 0)2加濕細(xì)胞孵育器中孵育2小時(shí)。孵育后，洗滌所述孔，并在RT下用麥胚凝集素 Alexa Flu〇r?:555綴合物（Invitrogen公司，cat#w32464)標(biāo)記巨卩策細(xì)胞15分鐘，同時(shí)搖 動(dòng)。然后洗滌所述孔，并用2%多聚甲醛在RT下固定30分鐘。然后洗滌所述孔，并保留在 黑暗、4°C下過夜。用掃描共聚焦顯微鏡（Quorum Wave FX-XISpinning Disc共聚焦系統(tǒng)， Quorum Technologies公司，Guelph, ON,加拿大）分析玻片。使用吞指數(shù)對(duì)對(duì)AML細(xì)胞 的吞噬作用進(jìn)行定量，如下：（巨噬細(xì)胞中的AML細(xì)胞的數(shù)目/巨噬細(xì)胞的數(shù)目）X 100 ;每 個(gè)樣品計(jì)數(shù)至少200個(gè)巨噬細(xì)胞。如圖3所示，TTI-621和TTI-622示出相似的促吞噬活 性，而TTI-616明顯較弱（在10nm的劑量下特別明顯）。這表明野生型IgG4或IgGl的Fc 區(qū)是使SIRP a Fc引發(fā)的巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷最大化所需的。
[0147] 利用