Egfr抑制劑的敏感性的預(yù)測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過(guò)檢查從受試者中以微侵襲（微創(chuàng)）方式采集的生物樣品中的 KRAS蛋白質(zhì)的基因型來(lái)預(yù)測(cè)該受試者對(duì)EGFR抑制劑的敏感性的方法。
[0002] 本申請(qǐng)基于2013年3月19日在日本提出的特愿2013-057033號(hào)申請(qǐng)主張優(yōu)先權(quán)， 并在此援引其內(nèi)容。
【背景技術(shù)】
[0003] 表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)是包含 EGFR (ErbB-1)、Her2/neu(ErbB-2)、 Her3(ErbB-3)以及Her4(ErbB-4)在內(nèi)的且非常密切相關(guān)的受體ErbB家族的成員。ErbB 家族是在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化以及生存中發(fā)揮重要作用的成長(zhǎng)因子受體的1型酪氨酸激酶家 族。對(duì)這些受體的激活而言，典型的是通過(guò)特異性配體結(jié)合來(lái)引起，且在受體家族成員之間 形成異源或同源二聚體。隨后，使其發(fā)生酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的自身磷酸化。
[0004] EGFR的激活，除了會(huì)誘導(dǎo)癌細(xì)胞的持續(xù)增殖和抑制作為生存中重要過(guò)程的細(xì)胞凋 亡，還會(huì)誘導(dǎo)受體酪氨酸激酶的激活以及介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)性、粘附性、浸潤(rùn)性和對(duì)化 療的耐受性的一系列下游信號(hào)傳導(dǎo)現(xiàn)象。
[0005] 另外，含有EGFR和HER2的該家族成員與細(xì)胞轉(zhuǎn)化直接相關(guān)。因此，作為抗癌劑， 目前正在開(kāi)發(fā)以EGFR作為靶點(diǎn)的分子靶向藥物。迄今為止，已進(jìn)行了抗EGFR抗體和小分 子EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI)這兩種主要類(lèi)型的EGFR抑制劑的臨床試驗(yàn)。西妥昔單抗 (Cetuximab)等抗EGFR抗體被設(shè)計(jì)成與EGFR的細(xì)胞外域結(jié)合以阻礙EGFR下游的信號(hào)的 激活。西妥昔單抗（其作為抗體225也是公知的，參見(jiàn)專(zhuān)利文獻(xiàn)1)是針對(duì)表達(dá)出高水平的 野生型EGFR的A431細(xì)胞進(jìn)行制作而成。與此相對(duì)比，吉非替尼（化合物ZD1839,易瑞沙） 和厄洛替尼（化合物0SI-774,特羅凱）等小分子TKI會(huì)競(jìng)爭(zhēng)用于結(jié)合在EGFR酪氨酸激酶 的細(xì)胞內(nèi)催化結(jié)構(gòu)域的ATP。其結(jié)果是，阻礙了 EGFR自身磷酸化和下游信號(hào)。
[0006] 近年來(lái)，在臨床上逐漸明確了作為大腸癌的分子靶向藥物的西妥昔單抗、帕尼單 抗的治療有效性與突變的KRAS基因或其蛋白質(zhì)之間的關(guān)系、作為肺癌的分子靶向藥物的 吉非替尼、厄洛替尼的治療有效性與突變的EGFR基因或其蛋白質(zhì)之間的關(guān)系、以及作為 ALK抑制劑的克唑替尼的治療有效性與伴隨易位的融合基因或其蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。在這 些藥物的使用中，包含檢查KRAS突變?cè)趦?nèi)的伴隨診斷（companion diagnostic)受到關(guān)注。 具體而言，在CRYSTAL(FOLFIRI)試驗(yàn)的III期（Phase III)大腸癌患者中，KRAS野生型患 者在西妥昔單抗并用時(shí)的有效率為59. 3%，與此相比，KRAS變異型患者在西妥昔單抗并用 時(shí)的有效率為36. 2%，針對(duì)KRAS變異型患者的西妥昔單抗的有效率戲劇性地達(dá)到了較低 的結(jié)果（例如，參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)。隨后，在OPUS(F0LF0X)試驗(yàn)的II期（Phase II)大腸 癌患者中，也證明了西妥昔單抗對(duì)KRAS變異型患者的有效率極低而對(duì)野生型患者是有效 的。根據(jù)這些試驗(yàn)效果，確定了在大腸癌患者中的突變KRAS基因成為EGFR抑制劑的治療 效果預(yù)測(cè)因子（例如，參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)2)。另外，還報(bào)告了，KRAS野生型組的治療效果也差 的情況下，BRAF、PIK3CA中存在變異的臨床試驗(yàn)結(jié)果。然而，目前的情況是作為超過(guò)KRAS 的超級(jí)無(wú)應(yīng)答者（super non-responder)證據(jù)還很少。
[0007] 在通過(guò)KRAS的基因診斷來(lái)進(jìn)行的EGFR抑制劑治療方面，存在如下3個(gè)與來(lái)自受 試者的樣品和耐藥性有關(guān)的問(wèn)題。
[0008] 第一個(gè)問(wèn)題是，在不進(jìn)行外科切除的病例中，雖然在KRAS基因診斷中使用活檢標(biāo) 本，但其可靠性沒(méi)有得到確認(rèn)。另外，活檢取材對(duì)于患者而言是侵襲性的，在切除原發(fā)灶后， 多數(shù)情況下無(wú)法再切除復(fù)發(fā)腫瘤。因此，人們期待一種可替代直接檢查腫瘤組織中的KRAS 狀況（KRAS的基因型）的方法的可靠性高的診斷標(biāo)志物。
[0009] 第二個(gè)問(wèn)題是不局限于轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶中的變異狀況一致的情況。
[0010] 渡邊等人報(bào)告了 43例大腸癌患者中有15例為變異型患者，而原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的 一致率為88. 4% (參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。即，原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶的KRAS變異狀況不一致的情 況約占一成。另一方面，S. Gattenlohner等報(bào)告了 EGFR抑制劑治療中原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的變 化。對(duì)21例轉(zhuǎn)移性大腸癌患者在治療前后的狀況進(jìn)行了研究，其結(jié)果是有20例（95.2%) 沒(méi)有發(fā)生改變。發(fā)生變化的一例是異質(zhì)性且為多發(fā)性病例（參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)4)。
[0011] 第三個(gè)問(wèn)題是在EGFR抑制劑治療中變異型克隆增加的可能性、即對(duì)EGFR抑制劑 的耐受性的獲得。Diaz Jr等人在24例原發(fā)灶為野生型的大腸癌病例中，在開(kāi)始進(jìn)行EGFR 抑制劑治療后，檢測(cè)到血漿中DNA的突變KRAS基因。其結(jié)果是，報(bào)告了從9例病例（37. 5% ) 中檢測(cè)到突變的KRAS基因，而且在全部病例中在投藥后至少第26周以前都觀察到變異，在 檢測(cè)到細(xì)胞外DNA變異的同時(shí)或者在觀察以后，獲得了耐受性。進(jìn)而，他們提出，通過(guò)以高 靈敏度檢測(cè)到血清中突變的KRAS基因，能夠推測(cè)獲得了 EGFR抑制劑的耐受性，且可改換成 例如MEK抑制劑等其他藥劑（參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)5)。另外，Misale等人還提出，通過(guò)以高靈 敏度檢測(cè)血漿中的KRAS基因變異，可預(yù)測(cè)對(duì)EGFR抑制劑的敏感性，以及在檢測(cè)到血漿中的 KRAS基因變異的情況下，可改換成除EGFR抑制劑以外的其他藥劑（參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。 艮P，在非專(zhuān)利文獻(xiàn)5和6中記載了，通過(guò)利用在循環(huán)DNA中也會(huì)檢測(cè)到受試者的轉(zhuǎn)移灶中存 在的KRAS這一點(diǎn)，檢查血液中的KRAS的狀況。另外，還記載了由此可檢查該轉(zhuǎn)移灶對(duì)EGFR 抑制劑的敏感性且可預(yù)測(cè)在將EGFR抑制劑供給該受試者的情況下的有效性的內(nèi)容。
[0012] 另一方面，作為癌癥的耐藥性問(wèn)題的突破口，進(jìn)行了與EGFR抑制劑的再給藥相關(guān) 的臨床試驗(yàn)。其確認(rèn)了，在再給藥EGFR抑制劑的情況下與不進(jìn)行再給藥相比，顯著延長(zhǎng)了 PFS (無(wú)進(jìn)展生存期）。其想法是，在進(jìn)行EGFR抑制劑治療中，變異型克隆增殖，獲得腫瘤對(duì) 上述EGFR抑制劑的耐受性，但通過(guò)改換成其他治療方法以使其變異型克隆相對(duì)減少，并在 此時(shí)再給藥EGFR抑制劑，由此再次奏效。實(shí)際上，進(jìn)行了如下再給藥的前瞻性研究，即在西 妥昔單抗對(duì)人的腫瘤患者的有效性降低時(shí)，使用其他療法進(jìn)行一定時(shí)期的治療，隨后再使 用西妥昔單抗進(jìn)行治療，對(duì)此D Santini等人報(bào)告了中間過(guò)程（參見(jiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)7)。在該 報(bào)告中，在KRAS野生型患者的首選治療（first line therapy)中給藥西妥昔單抗，并在有 效性降低時(shí)改換為其他抗癌治療方法（例如，XEL0X、F0LF0X等化療方法等），經(jīng)過(guò)一定時(shí)間 后，再給藥西妥昔單抗。在該前瞻性試驗(yàn)中，只有KRAS野生型患者的PFS得到延長(zhǎng)，并確認(rèn) 有顯著的延長(zhǎng)壽命的效果。
[0013] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0014] 專(zhuān)利文獻(xiàn)：
[0015] 專(zhuān)利文獻(xiàn)1 :美國(guó)專(zhuān)利第4943533號(hào)說(shuō)明書(shū)。
[0016] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 1 :Cutsem，et. al.，The New England Journal of Medicine，2009， vol. 360, pp.1408 - 1417 ;
[0017] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2 :Bokemeyer，et. al.，Annals of Oncology，2011，vol. 22 (7)， pp. 1535 - 1546 ；
[0018] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 3 :Watanabe，et. al.，Diseases of the Colon and Rect，2011， vol. 54,pp.1170 - 1178；
[0019] 非專(zhuān)利文獻(xiàn)4 :Gattenlohner，et. al.，New England Journal of Medicine，2009， vol. 360 (8), pp. 835；
[0020] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 5 :Diaz Jr，et. al.，Nature，2012, vol. 486, pp. 537 - 540；
[0021] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 6 :Misale，et.al.，Nature，2012, vol.486(7404)，pp.532 - 536 ;
[0022] 非專(zhuān)利文獻(xiàn) 7 :Santini，et. al.，Annals of Oncology，2012, vol. 23, pp. 2313 - 2318〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0023] 發(fā)明要解決的課題
[0024] 本發(fā)明涉及一種預(yù)測(cè)方法，其中，不論該患者的腫瘤組織中的KRAS的狀況如何， 以該患者的外周血（末梢血液）中的KRAS的狀況作為指標(biāo)，預(yù)測(cè)EGFR介導(dǎo)性腫瘤（癌） 的患者對(duì)EGFR抑制劑的敏感性。
[0025] 解決課題的方法
[0026] 為了解決上述課題，本發(fā)明人等進(jìn)行了精心研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在EGFR介導(dǎo)性腫 瘤（癌）的患者中，存在腫瘤組織中的KRAS的狀況和外周血中的KRAS的狀況不一致的情 況，而且，對(duì)于在腫瘤組織中沒(méi)有檢測(cè)到KRAS的變異型而在外周血中檢測(cè)到變異型KRAS的 患者而言，EGFR抑制劑的有效性低，從而完成了本發(fā)明。
[0027] 本發(fā)明的第一方面的EGFR抑制劑的敏感性的預(yù)測(cè)方法，包括：(a)確定工序，該工 序用以確定從受試者中采集的血液樣品中是否存在KRAS基因來(lái)源的核酸或其蛋白質(zhì)，以 及確定該血液樣品中的上述KRAS基因來(lái)源的核酸或其蛋白質(zhì)是野生型還是變異型；以及， (b)判斷工序，在上述工序（a)中，若在上述血液樣品中檢測(cè)到野生型KRAS基因來(lái)源的核酸 或其蛋白質(zhì)而沒(méi)有檢測(cè)到變異型KRAS基因來(lái)源的核酸或其蛋白質(zhì)，則判斷上述受試者的 腫瘤對(duì)EGFR抑制劑敏感的可能性高，若在上述血液樣品中檢測(cè)到變異型KRAS基因來(lái)源的 核酸或其蛋白質(zhì)，則判斷上述受試者的腫瘤對(duì)EGFR抑制劑不敏感的可能性高。
[0028] 在上述第一方面中，即使在從上述受試者的腫瘤采集的組織標(biāo)本或細(xì)胞標(biāo)本中檢 測(cè)到KRAS基因來(lái)源的核酸或其蛋白質(zhì)與從上述血液樣品中檢測(cè)到的上述KRAS基因來(lái)源的 核酸或其蛋白質(zhì)的基因型不同的情況下，在上述工序（b)中，若從上述受試者中采集的上 述血液樣品中檢測(cè)到上述變異型的KRAS基因來(lái)源的核酸或其蛋白質(zhì)，則也可判斷上述受 試者的上述腫瘤對(duì)EGF