與合成的β-1,6葡糖胺寡糖相關(guān)的方法和組合物的制作方法
【專利說明】與合成的（3-1,6葡糖胺寡糖相關(guān)的方法和組合物
[0001] 本申請為2009年7月21日提交的、發(fā)明名稱為"與合成的0 -1，6葡糖胺寡糖相 關(guān)的方法和組合物"的PCT申請PCT/US2009/004206的分案申請，所述PCT申請進入中國國 家階段的日期為2011年3月18日，申請?zhí)枮?00980136515. 1。
[0002] 相關(guān)申請
[0003] 本申請要求分別于2008年7月21日和2009年2月20日提交的美國臨時申請 61/135493和61/208155的優(yōu)先權(quán)，兩者的全部內(nèi)容均在此引入作為參考。
[0004] 政府支持
[0005] 本發(fā)明得到了美國國立衛(wèi)生研究所R01AI046706的部分支持。美國政府在本發(fā)明 中擁有權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
[0006] 本發(fā)明涉及與合成的寡-P - (1 - 6)-2-氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖苷相關(guān)的 組合物和方法，其中所述的寡-P - (1 - 6) -2-氨基-2-脫氧-D-吡喃葡萄糖苷在本文中與 寡-0 - (1 - 6) -D-葡糖胺或寡葡糖胺互換使用。
[0007] 發(fā)明背景
[0008] 葡萄球菌（Staphylococci)是正常棲息并寄居在人類皮膚與粘膜上的革蘭氏陽 性細菌。如果在手術(shù)或其它創(chuàng)傷過程中皮膚或粘膜受損，葡萄球菌就有機會進入內(nèi)部組織， 引起感染發(fā)生。如果葡萄球菌局部增殖或者進入淋巴或血液系統(tǒng)，可能造成嚴重感染并發(fā) 癥，例如與葡萄球菌型菌血癥有關(guān)的并發(fā)癥。這些并發(fā)癥包括感染性休克、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié) 炎、骨髓炎、肺炎以及各種器官的膿腫。
[0009] 葡萄球菌包括產(chǎn)生游離凝固酶的凝固酶陽性有機體和不產(chǎn)生游離凝固酶的凝固 酶陰性有機體。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)是最常見的凝固酶陽性葡萄球 菌。金黃色葡萄球菌通常造成局部感染，或者是血管外部位或者是血管內(nèi)部位，最終都可能 導(dǎo)致菌血癥。金黃色葡萄球菌還是急性骨髓炎的主要原因，并導(dǎo)致葡萄球菌性肺炎感染。此 外，金黃色葡萄球菌是造成大約1-9%細菌性腦膜炎病例和10-15%腦膿腫的原因。
[0010] 凝固酶陰性葡萄球菌已有至少31個已知的種類，其包括表皮葡萄球菌 (S. epidermidis)、腐生性葡萄球菌（S. saprophyticus)、人葡萄球菌（S. hominis)、 沃氏葡萄球菌（S. warneri)、溶血性葡萄球菌（S. haemolyticus)、腐生葡萄球菌 (S. saprophiticus)、科氏葡萄球菌（S. cohnii)、木糖葡萄球菌（S. xylosus)、模仿葡萄球 菌（S. simulans)和頭葡萄球菌（S. capitis)。表皮葡萄球菌是與靜脈內(nèi)進入裝置有關(guān)的最 經(jīng)常的致感染物，也是原發(fā)性醫(yī)院菌血癥最常見的分離物。表皮葡萄球菌還與人工瓣膜心 內(nèi)膜炎有關(guān)。
[0011] 葡萄球菌還是動物細菌感染的通常來源。例如，葡萄球菌性乳腺炎是反芻動物例 如牛、綿羊和山羊的常見問題。此疾病通常使用抗生素治療以減少感染，但是此治療過程花 費昂貴，并且仍會造成乳液產(chǎn)量的損失。迄今為止所鑒定的最有效的疫苗是皮下給藥的活 的完整金黃色葡萄球菌疫苗。然而，給藥活疫苗具有感染的風(fēng)險?；诖嗽?，許多研究者 試圖制備滅活的金黃色葡萄球菌疫苗，和/或分離可以誘導(dǎo)針對金黃色葡萄球菌免疫的莢 膜多糖或者細胞壁成分。
[0012] 有時在疫苗中使用載體化合物以提高針對抗原的免疫反應(yīng)。例如，某些疫苗中的 載體可用于刺激對抗原性部分（moiety)響應(yīng)的T細胞輔助。天然存在的抗原性部分或天 然存在的物質(zhì)的片段有時更不順從且更不易操作和/或綴合至其他部分例如載體化合物， 這會降低此類疫苗的治療效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013] 本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生抗原性組合物諸如但不限于疫苗的新方法和化合物。特別 是，本發(fā)明提供了用于修飾寡糖抗原的新方法。這些方法包括寡糖的受控合成，所述寡糖 (a)包含預(yù)定順序的單糖單體且（b)與載體化合物綴合。所得到的綴合物（conjugate)更 能夠刺激（通過誘導(dǎo)或增強）針對目標微生物多糖抗原的免疫反應(yīng)。如本文所描述的那樣， 此類免疫反應(yīng)可用于治療和/或預(yù)防各種感染，包括但不限于葡萄球菌感染。
[0014] 本發(fā)明的各方面涉及特殊的連接體（linker)(或連接因子或間隔基或連接劑，這 些術(shù)語在本文中可互換使用），以及他們在合成綴合物中的應(yīng)用。特別感興趣的是寡糖和各 種載體化合物的綴合物。這些寡糖包括寡-0 - (1 - 6) -D-葡糖胺（本文稱為：連接的葡糖 胺），其包含通過P -(1 - 6)連接彼此相連的葡糖胺單體。構(gòu)成該連接的葡糖胺的各單體 中的一個或多個可以是N-乙酰化的。因此，單體可以是D-葡糖胺或N-乙酰-D-葡糖胺單 體，并且該連接的葡糖胺可以包含確定順序的一種或兩種類型的這些單體（或單糖，在本 文中該術(shù)語可互換使用）。本發(fā)明的寡葡糖胺還在其"還原"末端包含間隔基，所述間隔基 具有含硫醇的基團。該間隔基用于將該寡葡糖胺與載體相連。載體可以包含氨基酸（諸如 肽或蛋白質(zhì)），盡管他們并不限于此。
[0015] 因此，在一方面，本發(fā)明提供了以下實施方案：
[0016] 1?式I的化合物
[0017]
[0018] 其中X是任意的原子或基團，Y是硫保護基，并且n大于1。
[0019] 2.實施方案1的化合物，其中Y是?；?。
[0020] 3.實施方案1或2的化合物，其中Y是乙?；⑶宜龌衔锞哂惺絀I的結(jié)構(gòu)
[0021]
12 其中Ac是乙醜基。 2 4.實施方案1的化合物，其中所述化合物是式I的活化的酯。
[0024] 5.實施方案1的化合物，其中所述化合物是式I的活化的酯的氰基、疊氮基或鹵素 衍生物。
[0025] 6.實施方案4的化合物，其中所述化合物具有式III的結(jié)構(gòu)
[0026]
[0027] (4-乙?；蛲榛∷酦-羥基琥珀酰亞氨基酯）
[0028] 其中Ac是乙醜基。
[0029] 7.實施方案4的化合物，其中所述化合物具有式IV的結(jié)構(gòu)：
[0030]
[0031] (4-乙酰基硫烷基丁酸N-硝基苯基酯）
[0032] 其中Ac是乙醜基。
[0033] 8.合成4-乙酰基硫烷基丁酸N-羥基琥珀酰亞氨基酯（式III)的方法，該方法包 括
[0034] 使4-乙?；蛲榛∷幔ㄊ絍)
[0035]
[0036] 其中Ac是乙醜基，
[0037] 與三氟乙酸N-羥基琥珀酰亞氨基酯（CF3COOSu)反應(yīng)，得到4-乙?；蛲榛?酸N-羥基琥珀酰亞氨基酯（式III)。
[0038] 9.合成4-乙酰基硫烷基丁酸N-硝基苯基酯（IV)的方法，該方法包括
[0039] 使4-乙?；蛲榛∷幔ㄊ絍)
[0040]
[0041] 其中Ac是乙醜基，
[0042] 與三氟乙酸N-硝基苯基酯（CF3C00pNp)反應(yīng)，得到4-乙?；蛲榛∷酦-硝基 苯基酯（式IV)。
[0043] 10.合成與載體綴合的寡糖的方法，該方法包括
[0044] 使寡糖首先與具有式Va或Vb結(jié)構(gòu)的化合物反應(yīng)
[0045]
[0046] 其中m是選自1至10的數(shù)字，p是選自1至20的數(shù)字，并且R是H或烷基，
[0047] 其次與式I、II、III或IV的化合物反應(yīng)，和
[0048] 隨后與載體反應(yīng)，
[0049] 其中所述的寡糖是P-1-6連接的葡糖胺。
[0050] 11.組合物，該組合物包含
[0051] 載有0-連接的連接體的寡糖，其中所述的連接體包含
[0052]
[0053] 12.實施方案11的組合物，其中所述的寡糖是P -1-6連接的葡糖胺。
[0054] 13.實施方案10或11的組合物，其中所述寡糖為2-20個單體長。
[0055] 14.實施方案10或11的組合物，其中所述寡糖為5-11個單體長。
[0056] 15.實施方案10或11的組合物，其中所述寡糖為7、9或11個單體長。
[0057] 16.實施方案15的組合物，其中所述的寡糖是100%乙酰化的。
[0058] 17.實施方案15的組合物，其中所述的多糖是少于50%乙?；摹?br>[0059] 18.包含寡糖-載體綴合物的組合物，其中所述的綴合物包含通過連接體與載體 綴合的寡糖，所述的連接體為
[0060]
[0061] 其中所述的連接體與寡糖0-連接并且與載體N-連接。
[0062] 19.實施方案18的組合物，其中所述的載體是肽。
[0063] 20.實施方案18的組合物，其中所述的載體是蛋白質(zhì)。
[0064] 21.實施方案18的組合物，其中所述的載體是破傷風(fēng)類毒素。
[0065] 22.實施方案18的組合物，其中所述的寡糖是P-1-6連接的葡糖胺。
[0066] 23.實施方案18的組合物，其中所述的組合物具有1:1、2:1、3:1、4 :1、5:1、6:1、 7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1 或 100:1 的寡糖與載體 的比例。
[0067] 24.實施方案22的組合物，其中所述寡糖為2-20個單體長。
[0068] 25.實施方案22的組合物，其中所述寡糖為5-11個單體長。
[0069] 26.實施方案22的組合物，其中所述寡糖為7、9或11個單體長。
[0070] 27.實施方案22的組合物，其中所述的寡糖是0-40%乙?；摹?br>[0071] 28.實施方案18的組合物，其還包含可藥用載體。
[0072] 29.實施方案18的組合物，其還包含佐劑。
[0073] 30.實施方案18的組合物，其還包含抗菌劑。
[0074] 31.合成寡糖-載體綴合物的方法，該方法包括使與式IXa或IXb的連接體綴合 的寡糖
[0075]
[0076] 與載體反應(yīng)，所述載體具有與式X化合物反應(yīng)后而修飾的氨基
[0077]
[0078] 得到通過具有式VIIIa或VIIIb的結(jié)構(gòu)的連接體與載體化合物綴合的寡糖。
[0079] 32.實施方案31的方法，其中所述的寡糖-載體綴合物具有1:1、2:1、3 :1、4:1、 5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1 或 100:1 的寡 糖與載體的比例。
[0080] 33.實施方案31的方法，其中所述的載體是肽。
[0081] 34.實施方案31的方法，其中所述的載體是蛋白質(zhì)。
[0082] 35.實施方案31的方法，其中所述的載體是破傷風(fēng)類毒素。
[0083] 36.實施方案31的方法，其中所述的寡糖是P -1-6連接的葡糖胺。
[0084] 37.實施方案31的方法，其中所述寡糖為2-20個單體長。
[0085] 38.實施方案31的方法，其中所述寡糖為5-11個單體長。
[0086] 39.實施方案31的方法，其中所述寡糖為7、9或11個單體長。
[0087] 40.實施方案36的方法，其中所述的寡糖是0-40%乙?；?。
[0088] 41.在受試者中刺激免疫反應(yīng)的方法，該方法包括
[0089] 給有需要的受試者施用在受試者中有效刺激免疫反應(yīng)的量的實施方案18-27任 一項實施方案的寡糖-載體綴合物或通過實施方案31-40任一項的方法合成的寡糖-載體 綴合物。
[0090] 42.實施方案41的方法，其中所述的受試者是人。
[0091] 43.實施方案41的方法，其中所述的受試者是非人類。
[0092] 44.實施方案41、42或43的方法，其還包括從所述受試者中分離抗體或形成抗體 的細胞。
[0093] 45.實施方案41、42、43或44的方法，其還包括向所述受試者施用佐劑。
[0094] 46.實施方案41-44或45的方法，其還包括向所述受試者施用抗菌劑。
[0095] 47.在受試者中治療或預(yù)防感染的方法，該方法包括
[0096] 向患有感染或有發(fā)展為感染的風(fēng)險的受試者施用誘導(dǎo)免疫反應(yīng)有效量的實施方 案18-27任一項實施方案的寡糖-載體綴合物或通過實施方案31-40任一項的方法合成的 寡糖-載體綴合物，
[0097] 其中所述的感染由制造PNAG的細菌種類所引起。
[0098] 48.實施方案47的方法，其中所述的感染是葡萄球菌感染。
[0099] 49.實施方案47的方法，其中所述的葡萄球菌感染是金黃色葡萄球菌感染。
[0100] 50.實施方案47的方法，其中所述的葡萄球菌感染是表皮葡萄球菌感染。
[0101] 51.實施方案47-49或50的方法，其中所述的受試者有暴露于葡萄球菌的風(fēng)險。
[0102] 52.實施方案47-49或50的方法，其中所述的受試者已暴露于葡萄球菌。
[0103] 53.實施方案47-51或52的方法，其中所述的感染是大腸桿菌感染、鼠疫桿菌感 染、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌感染、假結(jié)核性耶爾森氏菌感染、伴放線菌聚集菌感染、大葉性肺 炎放線桿菌感染、百日咳博德特氏菌感染、副百日咳博德特氏菌感染、支氣管敗血性博德特 氏菌感染、不動桿菌屬感染、伯克霍爾德氏菌屬感染、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌感染、志賀氏菌 屬感染或克雷伯氏菌屬感染。
[0104] 54.實施方案47-52或53的方法，其中所述的寡糖-載體綴合物與佐劑一起施 用。
[0105] 55.生產(chǎn)抗體的方法，該方法包括
[0106] 給受試者施用對于產(chǎn)生對PNAG特異的抗體有效量的實施方案18-27任一項實施 方案的寡糖-載體綴合物或通過實施方案31-40任一項的方法合成的寡糖-載體綴合物， 以及
[0107] 從該受試者分離抗體。
[0108] 56.生產(chǎn)單克隆抗體的方法，該方法包括
[0109] 給受試者施用對于產(chǎn)生對PNAG特異的抗體有效量的實施方案18-27任一項實施 方案的寡糖-載體綴合物或通過實施方案31-40任一項的方法合成的寡糖-載體綴合物，
[0110] 從所述受試者收獲產(chǎn)抗體細胞，
[0111] 使來自所述受試者的產(chǎn)抗體細胞與骨髓瘤細胞融合，以及
[0112] 收獲產(chǎn)自融合亞克隆的抗體。
[0113] 57.實施方案55的方法，其中所述的抗體是多克隆抗體。
[0114] 58.實施方案55或56的方法，其中所述的受試者是兔。
[0115] 59.實施方案55或56的方法，其中所述的受試者是人。
[0116] 在一個方面，本發(fā)明提供了式I的化合物
[0117]
[0118] 其中X是任意的原子或基團，Y是硫保護基（blocking group)，并且n大于1。在 一個實施方案中，Y是?；?。在另一實施方案中，Y是乙?；?，并且所述化合物具有式II的 結(jié)構(gòu)
[0119]
[0120] 其中Ac是乙醜基。
[0121] 在另一實施方案中，所述化合物是式I的活化的酯。在另一實施方案中，所述化合 物是式I的活化的酯的氰基、疊氮基或鹵素（haloid)衍生物。在另一實施方案中，所述化 合物具有式III的結(jié)構(gòu)
[012