一種制備恩拉霉素對照品的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于制藥工程領域，具體涉及一種制備恩拉霉素對照品的方法。
【背景技術】
[0002]恩拉霉素(Enramycin)是由土壤中分離出來的放線菌Streptomycesfungicid1us N0.B5477發(fā)酵產(chǎn)生的一種由不飽和脂肪酸和十幾種氨基酸結合成的多肽類抗生素。其中氨基酸分子構成環(huán)狀多肽結構，脂肪酸位于多肽結構末端，據(jù)其末端脂肪酸種類不同，分為恩拉霉素A(Ciq7H138CI2N26O31)和恩拉霉素B (CiqsH14qCI2N26O31)。恩拉霉素則是主要由這兩種成分組成的混合物(結構見圖1)。該藥于1966年由日本武田藥品工業(yè)株式會社研發(fā)，1974年在日本正式注冊，其后在許多國家被注冊和廣泛使用。其中，該藥于1993年在我國成功注冊，用于藥物飼料添加劑。恩拉霉素對革蘭氏陽性菌有很強的抑制作用，長期使用后不易產(chǎn)生抗藥性，而且恩拉霉素內服極不易被吸收，藥物主要通過糞便排出體外，殘留畜禽體內較少。除此之外，它還能改變腸道內的細菌群落分布，有利于飼料營養(yǎng)成份的消化吸收，促進動物增重和提高飼料利用率，因此被世界上許多國家推薦作為抗生素促生長劑，是一種不錯的飼料添加劑。
[0003]
[0004]目前，市場上使用的恩拉霉素都是恩拉霉素預混劑，其中恩拉霉素都未經(jīng)過純化。如專利ZL201010198230.5和CN201210120843.6公開的方法，其都是直接通過含有恩拉霉素的發(fā)酵液直接進行預混劑的制備。隨著生產(chǎn)技術的不斷發(fā)展，科研工作者正在不斷的對恩拉霉素的產(chǎn)品質量進行提高。如專利CN201210433028.5公開了一種恩拉霉素粗品的制備方法，其產(chǎn)品純度可達到70%左右；CN201210153458.1公開了一種通過大孔吸附樹脂純化得到90%以上純度恩拉霉素的方法；專利ZL201010213986.2涉及一種利用大孔弱酸性陽離子交換樹脂分離提取恩拉霉素的方法，該方法可以使得恩拉霉素的純度達到95%以上；專利ZL201110344875.X涉及一種從恩拉霉素發(fā)酵液種提取、分離和純化恩拉霉素的方法，該方法的流程為將恩拉霉素發(fā)酵液進過熱處理后，過濾，離心，收集菌體；向菌體加入甲醇溶液后，超聲，過濾；濾液先酸化后堿化，然后脫色，脫色液過大孔吸附樹脂進行吸附，用甲醇洗脫，收集洗脫液，經(jīng)濃縮結晶后，冷凍干燥得到恩拉霉素，該方法得到的恩拉霉素的純度達到95%左右；CN201310730536.4公開了一種通過弱酸性和弱堿性大孔吸附樹脂聯(lián)用的方法純化得到99%以上的恩拉霉素的方法。除此之外，ZL201210433029.X涉及一種反相層析制備高純度恩拉霉素A和B的方法，ZL201210159394.6涉及一種高壓液相制備恩拉霉素標準品的方法。
[0005]恩拉霉素對照品除了對純度有要求，其對恩拉霉素A和B的比例也有一定的要求，其最佳比例在1:1.1-1.8。就目前已有的技術來看，較高純度的恩拉霉素的制備方法雖然有很多，但是并沒有文獻公開恩拉霉素A和B在最佳比例范圍的高純度的恩拉霉素對照品的制備方法。本發(fā)明提供的方法不僅能夠很好地純化恩拉霉素，使恩拉霉素的純度達到95.0%以上，而且恩拉霉素A和B的比例不需要通過額外控制就能達到最佳。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種制備高純度的恩拉霉素對照品的方法。
[0007]本發(fā)明涉及一種制備恩拉霉素對照品的方法，所述方法包括:
[0008](I)提供恩拉霉素在pH值為6.0-7.5，醇的體積百分含量為30_40%的醇-水混合溶劑中的溶液；
[0009](2)將步驟⑴所述溶液連續(xù)上樣至裝填了非極性大孔吸附樹脂的樹脂柱中，直到流出液中恩拉霉素A:恩拉霉素B = I:2-2.5，停止上樣；
[0010](3)用pH值為2.0-4.0，醇的體積百分比為40% -80%的醇-水溶液洗脫步驟(2)所得樹脂柱，得到含有恩拉霉素對照品的洗脫液；
[0011](4)從步驟(3)所得洗脫液中分離得到恩拉霉素對照品。
[0012]其中，步驟(I)所述的pH值為6.5-7.0。
[0013]其中，步驟(I)所述溶液中醇的體積百分含量為35%，所述醇優(yōu)選為甲醇或乙醇。
[0014]其中，步驟⑴所述恩拉霉素中恩拉霉素A:恩拉霉素B= 1:1.5-4，優(yōu)選為1:2-3。
[0015]其中，步驟(2)所述非極性大孔吸附樹脂選自H60，HB60，H41或HP20ss，優(yōu)選H60。
[0016]其中，步驟(3)所述的醇-水溶液中醇的體積百分含量為40-70%，所述的醇優(yōu)選為甲醇或乙醇。
[0017]其中，步驟(3)所述的pH值為3.00
[0018]其中，步驟(4)所述恩拉霉素對照品中恩拉霉素A:恩拉霉素B = 1:1.1?1.8。
[0019]可以采用本領域技術人員公知的技術從步驟(3)所得洗脫液中分離得到恩拉霉素對照品，包括但不限于溶劑蒸發(fā)法，結晶等等。
[0020]在一個優(yōu)選的技術方案中，步驟⑷包括以下步驟:
[0021](i)收集并合并HPLC純度在90%以上的含有恩拉霉素對照品的洗脫液；
[0022](ii)將步驟⑴所得洗脫液濃縮至干，得到恩拉霉素對照品。
[0023]在另一個優(yōu)選的技術方案中，步驟(4)包括以下步驟:
[0024](i)收集并合并HPLC純度在90%以上的含有恩拉霉素對照品的洗脫液；
[0025](ii)超濾步驟(i)所得洗脫液；
[0026](iii)將步驟(ii)所得濾液pH值調至2.0-4.0，加入活性炭脫色并過濾；
[0027](iv)納濾步驟(iii)所得溶液；
[0028](V)將步驟(iv)所得濾液pH值調至6.0-8.0，得到恩拉霉素對照品的沉淀物；
[0029](vi)分離并干燥步驟(V)所得恩拉霉素對照品的沉淀物。
[0030]其中，步驟(ii)所述超濾的截留分子量范圍為5000-20000D，優(yōu)選10000D ?’步驟(iv)所述納濾的截留分子量范圍為200-1000D，優(yōu)選200-500D。
[0031]如無特別說明，本發(fā)明所述的恩拉霉素A與恩拉霉素B的比值指的是恩拉霉素A與恩拉霉素B的HPLC色譜含量比。
[0032]本發(fā)明的優(yōu)勢在于:
[0033]本發(fā)明所述方法制備得到的恩拉霉素對照品純度可以達到95.0%以上，而且所得對照品中恩拉霉素A和B的比值不需要通過額外控制就能達到1:1.1-1.8的最佳比值范圍，操作非常簡單方便，另外本發(fā)明的方法收率高，非常適于工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
圖1恩拉霉素A和B的結構式
【具體實施方式】
[0034]以下通過實施例對本發(fā)明進行詳細說明。必須指出，這些實施例是用于說明本發(fā)明，而不應理解為對本發(fā)明的限制。
[0035]以下實施例中所述的恩拉霉素發(fā)酵液可以采用本領域常用的產(chǎn)恩拉霉素的菌株進行發(fā)酵后得到。比如通過發(fā)酵殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)得到含有恩拉霉素的發(fā)酵液。(Higashide E, Hatano K, Shibata M, Nakazawa K.Enduracidin, anew antib1tic.1.Streptomyces fungicidicus N0.B5477, an enduracidin producingorganism.J Antib1t (Tokyo).1968, 21 (2):126-37.)
[0036]以下實施例選用的HPLC分析檢測方法為:
[0037]色譜柱-Agilent HC_C1S4.6 X 250mm，5 μ m ;
[0038]流動相:緩沖液(3.0ml磷酸+500ml /K，用NaOH調節(jié)pH = 3.8)/甲醇/乙腈=500/300/200(v/v/v)；
[0039]檢測波長:232nm；
[0040]流速:1.0m