一種干擾素突變體及聚乙二醇衍生物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及IFN-A1突變體、其聚乙二醇衍生物及其制備方法，以及包含所述 IFN-X1突變體或該突變體的聚乙二醇衍生物在預防或治療病毒性疾病、腫瘤方面的應用。
【背景技術】
[0002] 干擾素是一類重要的家族性細胞因子，具有廣譜的抗病毒、抗細胞增殖和免疫調(diào) 節(jié)作用。
[0003] 迄今，已經(jīng)鑒定到6種形式的干擾素，它們分為三個大組。所謂的"I型"干擾素包 括干擾素ct、干擾素0、干擾素《、干擾素S、干擾素T。目前，干擾素Y和干擾素a的 一個亞類是僅有的II型干擾素。III型干擾素是最近發(fā)現(xiàn)的一類細胞因子家族，包括干擾 素X1、入2和入3,也稱為IL-28A、IL-28B和IL-29
[0004]IL-28A、IL-28B和IL-29包含最近發(fā)現(xiàn)的新蛋白家族，所述蛋白質(zhì)家族與I型干 擾素有序列同源性，并與IL-10有基因序列的同源性。該新家族在共同所有的PCT申請 W002/086087 和Sh印pard等，NatureImmunol. 4:63-68, 2003(全文都納入本文參考）中有 詳細的描述。從功能上說，IL-28和IL-29類似于I型干擾素，均能誘導細胞中的抗病毒狀 態(tài)，與I型干擾素不同的是，它們不顯示出抗某些B細胞系的抗增殖活性。
[0005] 野生型幾-29(干擾素X1)基因編碼200個氨基酸多肽，該蛋白質(zhì)成熟氨基酸序 列顯示在SEQIDNO: 1中，編碼本文所述的IL-29多肽區(qū)域、域、基序、殘基和序列的相應多 核苷酸顯示在SEQIDN0:2中。IL-29的螺旋預測如下：螺旋A有氨基酸殘基30 (Ser)至 44 (Leu)所定義；螺旋B由氨基酸殘基57 (Asn)至65 (Val)所定義；螺旋C有氨基酸殘基 70 (Val)至85 (Ala)所定義；螺旋D由氨基酸殘基92 (Lys)至111 (Gln)所定義；螺旋E由 氨基酸殘基118 (Thr)至139 (Lys)所定義；而螺旋F由氨基酸殘基144 (Gly)至170 (Leu) 所定義。
[0006]已知IL-29分子具有5個半胱氨酸殘基（PCT申請W002/086087W002/02627)，基于 多重比對進行的IL-29的進一步分析預測，氨基酸殘基第49和145位，及第112和171位 的半胱氨酸將形成分子內(nèi)二硫鍵，第15位的半胱氨酸是游離的，可以形成分子間二硫鍵。
[0007] 無論是I型干擾素、II型干擾素還是III型干擾素，作為蛋白質(zhì)藥物，由于穩(wěn)定性 差、血漿清除率高，體內(nèi)半衰期短，易產(chǎn)生抗原抗體等，在臨床治療中很大的限制?；蚬こ?技術使大規(guī)模合成人重組蛋白成為可能，工程蛋白通過改變野生蛋白序列中的某個或某幾 個氨基酸，以獲得相對更為穩(wěn)定、比活性更高的重組蛋白，并降低其免疫原性，這在一定程 度上解決了異源蛋白引起的不穩(wěn)定或免疫原性問題。
[0008] 盡管這樣，還無法克服血漿清除快和生物利用度低等缺點，這些缺點造成的結(jié)果 是：需頻繁注射干擾素才能達到有效血漿治療濃度；而且，每次注射后均會導致血藥濃度 的較大波動，形成藥物濃度的峰值和谷值。這樣就可能增加了治療費用以及給藥不便和不 良反應的風險。因此，人們試圖采用各種藥物傳遞技術來提高蛋白質(zhì)藥物的療效。
[0009] 蛋白藥物的生物利用度通常受血漿半衰期的限制，并且對蛋白酶降解敏感，阻礙 在臨床治療上的應用聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的技術是近年來發(fā)展起來的一種用于改進蛋白 質(zhì)類藥物體內(nèi)藥動學性質(zhì)的新技術。它是將活化的聚乙二醇分子（PEG)鍵合到蛋白質(zhì)分子 表面上，從而影響蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，最終導致蛋白質(zhì)各種生物化學性質(zhì)的改變，如：化學 穩(wěn)定性增加，抵抗蛋白酶水解能力提高，免疫原性和毒性降低消失，體內(nèi)半衰期延長，血漿 清除率降低等等。
[0010] 發(fā)明概述
[0011]IFN-A1上有多處氨基酸可供進行突變，但這些氨基酸序列的改變應當考慮 IFN-A1的折疊及空間結(jié)構(gòu)不受影響、并至少得到可以保持相當于野生型IFN-A1活性的 突變體。本發(fā)明的目的是提供一種在第123位氨基酸進行突變得到的一種新型的突變體 IFN-A1，將第123位的Pro突變?yōu)镾er，該突變體相對于野生型IFN-A1，活性更強、穩(wěn)定性 更好。
[0012] 本發(fā)明提供制備可溶性IFN-X1突變體的方法，該方法通過先構(gòu)建設計IFN-入1 突變體引物，構(gòu)建獲得突變體基因，將所得基因插入到表達載體，將所得的載體轉(zhuǎn)入到宿主 大腸桿菌中，得到相應的表達工程菌，再進行發(fā)酵和誘導表達、包涵體變性和復性，得到可 溶性IFN-入1突變體。
[0013] 所需的蛋白質(zhì)從可溶性細胞質(zhì)部分，可溶性周質(zhì)部分、培養(yǎng)基的可溶性部分以及 包涵體中回收和純化，可使用從培養(yǎng)基、細胞質(zhì)、周質(zhì)部分以及包涵體中回收和純化蛋白質(zhì) 的任何方法，這些回收和純化方法是已知的或本領域的技術人員容易確定的，包括，但不限 于，離心，過濾，透析，層析（包括分子排阻層析）等方法?；厥蘸图兓璧鞍踪|(zhì)的合適方 法部分取決于蛋白質(zhì)的特性和目的用途。
[0014] 為實現(xiàn)所采取的技術方案是利用蛋白工程技術，對SEQIDNO:1所示的氨基酸序 列進行定點突變，將123位的Pro突變?yōu)镾er，具體方法是：
[0015] 1)利用體外定點突變技術獲得編碼目的蛋白的重組基因；
[0016] 2)將此重組基因插入到表達載體中獲得可編碼重組蛋白的重組質(zhì)粒，所述表達載 體包括但不限于pET-23b;
[0017] 3)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞獲得可穩(wěn)定表達目的蛋白的工程菌，所述 大腸桿菌感受態(tài)細胞包括但不限于BL21(DE3);
[0018] 4)工程菌以包含體形式表達的目的蛋白。表達產(chǎn)物包涵體形式存在，表達量占菌 體總蛋白的40%以上，重組蛋白的純化依次采用Blue染料親和層析、銅離子親和層析、CM 弱陽離子交換層析三步純化工藝，可以得到高純度的重組目的蛋白IFN-A1突變體。
[0019] 本發(fā)明的個目的是提供如上所述的IFN-X1突變體的聚乙二醇衍生物及其制備 方法，通過硫醇反應使聚乙二醇（PEG)試劑與IFN-A1中的游離半胱氨酸殘基反應獲得特 異性偶聯(lián)物，所得產(chǎn)物中，PEG實現(xiàn)在游離半胱氨酸定點修飾，得到的PEG-IFN-X1突變體。 較未PEG化的IFN-M相比，所得的PEG-IFN-M具有穩(wěn)定性提高、免疫原性減弱。
[0020] 一般來說，PEG化蛋白質(zhì)方法類似W09412219(Cox和McDermott)和W09422466(Cox 和Russell)中所述的方法，并略加改良，本文引用這兩篇文獻以供參考。將含游離半胱氨 酸的多肽或蛋白質(zhì)與過量的"巰基化PEG"相接觸（一般PEG:蛋白質(zhì)或多肽的摩爾比為 1:1、5:1、10:1、和50:1)攪拌進行反應，反應條件中優(yōu)選的溫度是4°C到37°C;優(yōu)選的pH范 圍可以從6. 5到9. 5,但更優(yōu)選為7. 5到8. 5。使用SDS-PAGE測定分子量的改變可檢測蛋 白質(zhì)的PEG化，一般認為產(chǎn)生大量單PEG化產(chǎn)物而不產(chǎn)生二PEG化產(chǎn)物的PEG的最低量是 最佳的（一般認為80%轉(zhuǎn)變成單PEG化產(chǎn)物是較好的）。
[0021] 本發(fā)明半胱氨酸以形成"PEG化"蛋白質(zhì)的"PEG部分"包括任何合適的多聚 體，例如，線性或帶支鏈的多元醇。優(yōu)選的多元醇是聚乙二醇，它是環(huán)氧乙烷單元組成 的合成多聚體，可改變環(huán)氧乙烷單元以便通過大小排阻層析獲得表觀分子量范圍大約為 3, 000-70,OOODa的PEG化蛋白質(zhì)變異體。PEG部分的大小直接影響其循環(huán)半衰期。因此， 可通過改變PEG部分的大小或結(jié)構(gòu)來加工具有不同循環(huán)半衰期的蛋白變異體使之用于具 體治療應用或優(yōu)選的劑量方案。
[0022] 如本申請所用的"巰基化反應性PEG化劑"指任何與半胱氨酸殘基的巰醇基團反 應的PEG衍生物，這些用于半胱氨酸殘基修飾的反應性PEG末端基團，其包括但不限于二 硫?qū)拎?、乙烯砜、馬來酰亞胺、碘乙酰胺。PEG末端基團應對游離巰基具有特異性，實現(xiàn)單 PEG化。但在不損傷蛋白質(zhì)的條件下發(fā)生反應。以其單-甲氧基化形式使用的PEG化劑，其 中僅一個末端能被偶聯(lián)。
[0023] 術語"單PEG化"定義為通過單個PEG部分共價附著到蛋白質(zhì)的特定位點而修飾 的蛋白質(zhì)。"單PEG化"方法可使用本領域的技術人員已知的任何方法，包括，但不限于，本 發(fā)明實施例中所列舉的方法。
[0024] 在本發(fā)明中，優(yōu)選的巰基化劑為mPEG-二硫?qū)拎ぃ╩PEG-OPSS)或mPEG-馬來酰 亞胺（mPEG-MAL)。值得注意的是，上述兩個PEG化劑與IFN-X的反應是位點特異性的，分 別是在IFN-A1的游離的15Cys而其他天然存在的Cys殘基位點由于易形成分子內(nèi)二硫鍵， 不和硫醇反應性PEG化劑反應。