。
[0038] 實施本發(fā)明的技術(shù)方案，可以獲得以下技術(shù)效果：本發(fā)明的重組利鈉肽同時具有 心房利鈉肽及蛇利鈉肽的生物學特性，生理作用顯著增強，藥物半衰期明顯延長；本發(fā)明的 制備工藝簡易可行；新型重組利鈉肽基因工程藥物可有效作用于心臟血管以及腎臟等效應 器官，發(fā)揮利尿、排鈉、提高腎小球濾過率、擴張血管等作用從而有效保護上述器官的生理 功能，達到預防和治療心臟衰竭及腎衰竭等嚴重疾病。
【附圖說明】
[0039] 以下將結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。附圖中：
[0040] 圖1是人心房利鈉膚的不意圖；
[0041] 圖2是蛇利鈉肽的示意圖；
[0042] 圖3是本發(fā)明實施例中制備得到的新型重組利鈉肽的示意圖；
[0043] 圖4是以人心臟cDNA為模板，以全長人心房利鈉肽基因（pre-ANP)的上游和下游 引物擴增，獲得約450bp大小目的基因片段；
[0044] 圖5以人全長人心房利鈉肽基因（pre-ANP)為模板，分別以引物序列3和引物序 列4為上游和下游引物擴增，獲得約120bp大小的第一基因片段；
[0045] 圖6以圖5中120bp的第一基因片段為模板，分別以引物序列3和引物序列5為 上游和下游引物擴增，獲得約135bp大小的基因片段；
[0046] 圖7是圖6中擴增得到的ADNP基因片段的測序分析圖；
[0047] 圖8分離純化獲得的重組利鈉肽分子。
【具體實施方式】
[0048] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對 本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0049] 現(xiàn)有技術(shù)中將心房利鈉肽治療急性心衰時，其半衰期非常短、生理效應作用不強， 使得急性心衰治療效果不理想。本發(fā)明的主要創(chuàng)新點在于：提供一種基于基因工程技術(shù)制 備的新型重組利鈉肽（ADNP)，該重組利鈉肽具有心房利鈉肽（ANP)構(gòu)成的N末端和由蛇利 鈉肽（DNP)構(gòu)成的C末端，同時具有心房利鈉肽及蛇利鈉肽的特性，具有與效應受體結(jié)合能 力最強的心房利鈉肽（ANP)的N末端，同時具有與清除受體結(jié)合能力最弱、且對中性內(nèi)肽酶 (NEP)的酶解消化作用具有更強抵抗力的蛇利鈉肽（DNP)的C末端，從而使藥物的特異性 作用顯著增強，半衰期明顯延長，可高效率作用于心臟、血管、腎臟等效應器官，有效保護心 臟、腎臟及其他器官的功能，達到保護、預防和治療心臟、腎臟及其他器官衰竭疾病的目的。
[0050] 圖3示出了重組利鈉肽的肽鏈結(jié)構(gòu)，如圖3所示，本發(fā)明的重組利鈉肽由38個氨 基酸組成，其中N末端為人心房利鈉肽N末端的23個氨基酸，兩個半胱氨酸殘基形成的二 硫鍵環(huán)狀結(jié)構(gòu)；C末端為蛇利鈉肽C末端的15個氨基酸。即，包括一個完整的人心房利鈉 肽的環(huán)狀功能區(qū)，所述蛇利鈉肽具有完整的蛇利鈉肽C末端的15個氨基酸，本發(fā)明的重組 利鈉肽從N末端到C末端的序列為：
[0051] SLRRSSCFGGRMDRIGAQSGLGCPSLRDPRPNAPS TSA
[0052] 本發(fā)明同時還提供一種上述基因工程新型重組利鈉肽的制備方法，所述方法包括 以下步驟：
[0053] S1、分別獲取心房利鈉肽基因的N末端基因片段和蛇利鈉肽基因的C末端基因片 段。優(yōu)選的，獲取的所述心房利鈉肽基因為人心房利鈉肽基因。
[0054] S2、通過PCR的方法合成重組利鈉肽基因，所述重組利鈉肽基因的N末端為所述心 房利鈉肽基因的N末端基因片段，所述重組利鈉肽基因的C末端為所述蛇利鈉肽基因的C 末端基因片段；
[0055] S3、構(gòu)建表達載體；
[0056] S4、表達。
[0057] 優(yōu)選的，上述步驟Sl進一步包括：
[0058] S101、獲取全長人心房利鈉肽基因。
[0059] 在美國國立生物信息中心（NCBI)數(shù)據(jù)庫中查找人心房利鈉肽基因序列，設計上 游和下游引物，分別為：
[0060] 上游引物的引物序列1為序列列表中序列1所示核苷酸序列：5'-ATGAGCTCC TTCTCCACCACCACCGTGAGC-3' ，
[0061] 下游引物的引物序列2為序列列表中序列2所示核苷酸序列：5'-TCAGTACCG GAAGCTGTTACAGCCCAGTCCGCT-3,。
[0062] 以人心臟cDNA為模板，以全長人心房利鈉肽基因（pre-ANP)的上游和下游引物擴 增，獲得約450bp大小的基因片段（見圖4)，經(jīng)基因測序分析證實為目的基因。
[0063] S102、通過PCR的方法獲取所述人心房利鈉肽基因的N末端基因片段。
[0064]從步驟SlOl中獲得的全長人心房利鈉肽基因（pre-ANP)中釣取人心房利鈉肽基 因（ANP)N末端基因片段，設計含有酶切位點的上游和下游引物，分別為：
[0065] 上游引物的引物序列3為序列列表中序列3所示核苷酸序列：5'-GAATTCGTT CGTGGTCCGCGTTCTCTTCGTCGTTCTTCTJ
[0066] 下游引物的引物序列4為序列列表中序列4所示核苷酸序列：5'-AGCGTTCGG ACGCGGGTCACGCAGGCTCGGGCATCCAAGACCAGACTG-3'。
[0067]S103、合成所述蛇利鈉肽基因的C末端基因片段。
[0068] 在美國國立生物信息中心（NCBI)數(shù)據(jù)庫中，找到蛇利鈉肽（DNP)基因序列，并進 行相應的生物信息學分析。合成蛇利鈉肽（DNP)基因C末端序列，設計同時含有酶切位點， 設計的引物序列為
[0069] 引物序列5為序列列表中序列5所示核苷酸序列：5'-GTGGATCCTCAAGCGCT AGTGCTCGGAGCGTTCGGACGCGGGTCACG-3'，
[0070] 在引物中引入了BamHI酶切位點用作后續(xù)PCR擴增拼接合成重組利鈉肽（ADNP)。
[0071] 優(yōu)選的，所述步驟S2進一步包括：
[0072] 以人全長人心房利鈉肽基因（pre-ANP)為模板，分別以引物序列3和引物序列4 為上游和下游引物擴增，獲得約120bp大小的第一基因片段，其中含有ANP的N末端69bp 片段和DNPC末端30bp片段（見圖5)。隨后，以上述120bp的第一基因片段為模板，分別 以引物序列3和引物序列5為上游和下游引物擴增，獲得約135bp大小的基因片段（見圖 6)，其中含有BNPN末端69bp片段和DNPC末端45bp片段，即為重組利鈉肽（ADNP)基因 (見序列表中序列6所示核苷酸序列）。將擴增得到的ADNP基因片段直接連接到表達載體 中，經(jīng)基因測序分析證實為所需要的目的基因（見圖7)。
[0073] 優(yōu)選的，所述步驟S3中，所述表達載體為pGEX-4T-l或pCW;所述步驟S4中，所述 表達菌株為DH5a、BL21、Rosetta或Rosetta-gami。
[0074] 將重組利鈉肽ADNP基因片段的PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和BamHI酶切后連接插入相 同酶切的原核表達載體PGEX-4T-1或pCW中，構(gòu)建成含有ADNP基因的重組質(zhì)粒pGEX-ADNP 或pCW-ADNP。更優(yōu)選的，使用的重組質(zhì)粒pGEX-ADNP轉(zhuǎn)入表達載體，為后續(xù)純化重組利鈉肽 分子的方便。
[0075] 為了使重組利鈉肽（ADNP)在原核表達系統(tǒng)即大腸桿菌菌株中得到高水平的 表達，本發(fā)明選擇了多種表達菌株進行了表達條件的探索，表達菌株包括DH5a、BL21、 Rosetta或Rosetta-gami等，綜合考慮表達產(chǎn)物的可溶性、表達產(chǎn)物的產(chǎn)量、細菌生長狀 態(tài)、細菌培養(yǎng)基成分等諸方面因素，更優(yōu)選的，使用BL21和Rosetta來建立表達菌株。
[0076] 優(yōu)選的，在所述步驟S4之后還包括：
[0077]S5、離心收集表達菌株的菌體，分離純化得到所述新型重組利鈉肽分子（見圖8)。
[0078] 通過上述制備方法工藝簡單可行，獲得重組利鈉肽分子具有如下優(yōu)點：
[0079] (I)