抗vegfr2人源納米抗體ntv1及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制藥領域。更具體地，本發(fā)明涉及一種VEGFR2納米抗體、該抗體 的制備方法以及該抗體在制備抗癌癥藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 惡性腫瘤是當前嚴重影響人類健康、威脅人類生命的主要疾病之一，截止2012 年，全世界有超過820萬人死于癌癥，世界衛(wèi)生組織和各國政府衛(wèi)生部門都把攻克癌癥列 為一項首要任務。但是腫瘤的治療仍然是當今醫(yī)學界的難題，研究人員一直在尋找腫瘤治 療的新方向。通過研究腫瘤發(fā)現(xiàn)，血管生成是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的必要條件，而血管內(nèi)皮生長 因子受體（vascularendothelialgrowthfactorreceptor,VEGFR)作為血管生成關鍵因 子VEGF的受體也成為抗腫瘤藥物的靶向的研究熱點。
[0003]腫瘤血管為腫瘤的生長提供了充足的營養(yǎng)供給，同時也促進了癌細胞的擴散和轉 移。VEGF是主要作用于血管內(nèi)皮細胞的生長因子，具有促進內(nèi)皮細胞增殖、增加微血管通 透性、誘導血管生成等多種功能。已有研究證實VEGF的高表達與實體腫瘤的形成及其轉 移、風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、動脈硬化等疾病有著密切關系。VEGF通過 與血管內(nèi)皮細胞膜上的特異性受體VEGFR結合來激活信號傳導。VEGFR家族的成員包括： VEGFRl、VEGFR2和VEGFR3。它們均為跨膜蛋白，由胞外的7個免疫球蛋白樣的功能域、胞內(nèi) 的酪氨酸激酶功能域和中間的一段跨膜序列組成。其中VEGFR2定位于人4qll_12,由1356 個氨基酸構成，可促進血管內(nèi)皮細胞增殖、遷移及增加毛細血管通透性。研究已經(jīng)證實，腫 瘤血管內(nèi)皮細胞的有絲分裂與腫瘤微血管的滲透性主要是通過VEGF與VEGFR2的相互作用 而發(fā)生的。VEGFR2在健康的成人身體內(nèi)表達水平很低甚至不表達；而在許多腫瘤中，例如 乳腺癌、肺癌、膀胱癌、結腸癌、宮頸癌、肝細胞癌、成血管細胞瘤、腦膠質瘤等的腫瘤血管內(nèi) 皮細胞中是高表達的。另外，VEGFR2胞外區(qū)部分缺失實驗證實：VEGF主要是通過與VEGFR2 胞外的I-III區(qū)特異性結合來發(fā)生信號傳導的。
[0004] 自從Kohler和Milstein發(fā)明雜交瘤技術制備單克隆抗體以來的幾十年中，抗體 已被廣泛應用于臨床疾病的診斷和治療。目前治療性單克隆抗體藥物已經(jīng)成為生物制藥中 增長最快的領域，單抗藥物以靶向性強、療效明確、副作用小等優(yōu)勢在自身免疫性疾病、癌 癥等領域應用廣泛。其中，抗腫瘤血管生成抗體具有靶向性、特異性、專一性等特性，能特異 性阻斷腫瘤血管的發(fā)生發(fā)展，降低對其他組織的殺傷作用。目前用于臨床的抗腫瘤血管生 成的抗體藥物貝伐單抗（bevacizumab，Avastin)于2004年被美國FDA批準用于非小細胞 肺癌的治療，并在其他腫瘤的治療中表現(xiàn)出良好的療效。然而，由于其對VEGFRl和VEGFR3 的也有抑制作用，全面阻斷了VEGF介導的相關信號通路，導致患者出現(xiàn)高血壓、鼻出血、蛋 白尿等嚴重不良反應。駱駝體內(nèi)天然存在缺失輕鏈的重鏈抗體，其可變區(qū)是最小的功能性 抗原結合片段。一般來說，這類抗體的相對分子質量為15KDa，僅為常規(guī)抗體的1/10,其分 子高度為4. 8nm，直徑為2. 2nm，故稱為納米抗體（nanobody)。納米抗體作為最小的功能性 抗原結合片段，獨特的生物學結構特征賦予了它們許多優(yōu)勢，如穩(wěn)定性強、可溶性好、免疫 原性低、容易表達等等。納米抗體含有3個互補決定區(qū)（complementaritydetermining regions，⑶Rs)。從納米抗體的立體結構發(fā)現(xiàn)，較長的⑶R3與相鄰的⑶Rl或⑶R2由二硫 鍵連接成環(huán)來穩(wěn)定構象。傳統(tǒng)抗體Fab片段及單鏈抗體ScFv抗體的抗原結合區(qū)形成凹形 的或平面結構，只能識別位于抗原表面的位點，而重鏈抗體的CDR3較長，可形成穩(wěn)定的大 凸環(huán)結構，深入具有裂縫凹陷結構的抗原內(nèi)部，例如酶的活性位點、病毒與宿主細胞結合位 點等。因此納米抗體具有更加廣泛的抗原結合力。其次，納米抗體的CDRl區(qū)和骨架區(qū)存在 半胱氨酸殘基（Cys)，可以和CDR3區(qū)中的Cys殘基形成二硫橋，增加了可變區(qū)的穩(wěn)定性和結 構變化。另外，納米抗體具有分子量小、穿透力較強并且可以制備成多功能抗體或者攜帶化 藥等特點，使得這類抗體在對實體瘤和需要穿過血腦屏障疾病的治療中具有顯著優(yōu)勢。除 此之外，隨機突變及噬菌體展示等技術的引入也使得納米抗體文庫的構建及特異性納米抗 體的篩選過程變得更加便捷、高效。VEGFR2是最重要的藥物靶點之一，具有廣闊的研發(fā)前景 和重要的現(xiàn)實意義。然而，傳統(tǒng)抗體親和力成熟、蛋白表達純化和生物效應的技術瓶頸嚴重 的限制了VEGFR2抗體藥物的研發(fā)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明的目的之一是提供一種具有高親和力和良好抗腫 瘤活性的、高效、毒副作用低且易于生產(chǎn)的抗VEGFR2人源納米抗體。
[0006] 本發(fā)明另一方面的目的是提供一種制備上述抗體的方法。
[0007] 本發(fā)明又一方面的目的是提供上述抗體在制備用于治療抗腫瘤藥物中的用途。
[0008] 為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下的技術方案：
[0009] 本發(fā)明提供一種抗VEGFR2人源納米抗體，包括框架區(qū)和互補決定區(qū)，其特征在 于，所述納米抗體具有SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列。
[0010] 本發(fā)明還提供一種制備抗VEGFR2納米抗體的制備方法，包括以下步驟：
[0011] a.采用噬菌體展示技術篩選出與VEGFR2結合的納米抗體，并通過基因比對分析， 挑選出重復最高的序列；
[0012] b.將上一步篩選出的納米抗體重新構建于表達載體中，并采用原核細胞表達系統(tǒng) 表達，獲得商純度蛋白；以及
[0013] c.采用AlphaScreen技術從上一步篩選出的納米抗體中進一步篩選出的親和力 最1?的抗體。
[0014] 下面對上述步驟進行更詳細的描述。
[0015]a.采用噬菌體展示技術篩選與VEGFR2結合的納米抗體
[0016] 優(yōu)選地，首先采用生物淘選技術篩選陽性噬菌體，并將陽性克隆在宿主菌TGl中 擴增富集；然后進行陽性克隆DNA序列測定、基因比對分析，從中挑選出重復最高的序列。[0017] 更優(yōu)選地，首先采用液相淘選技術將抗原固定在磁珠表面，加入含有人源納米抗 體庫的結合液中，篩選陽性噬菌體，并將陽性克隆在宿主菌TGl中擴增富集，優(yōu)選地，所述 擴增進行4輪；然后在最后兩輪淘選中隨機挑選陽性克隆進行基因測序及基因比對分析， 從中挑選出重復次數(shù)最高的序列。
[0018]b.納米抗體的表達純化
[0019] 優(yōu)選地，將挑選出的序列應用NotI和BamHI限制性內(nèi)切酶及DNA重組技術將酶 切后的PCR擴增產(chǎn)物插入攜帶6His-sum〇標簽的酶切線性化的pET載體中，構建表達質粒； 將質粒轉化至宿主菌中培養(yǎng)至對數(shù)期，誘導表達；收集細菌沉淀，超聲法充分裂解細菌，取 上清，為粗提蛋白；粗提蛋白經(jīng)過鎳親和柱及分子篩柱，得到純化蛋白樣品；用電泳檢測目 的蛋白的表達，對出現(xiàn)頻率較高的克隆進行原核系統(tǒng)表達純化。
[0020] c.納米抗體親和力篩選優(yōu)選地，采用AlphaScreen技術測定抗原和抗體間的相互 作用，進一步篩選出的親和力最高的抗體。
[0021] 本發(fā)明還提供以上所述的抗VEGFR2人源納米抗體在制備用于抗癌癥藥物中的用 途。
[0022] 其中，所述癌癥包括乳腺癌、肺癌、膀胱癌、結腸癌、宮頸癌、肝細胞癌、成血管細胞 瘤、腦膠質瘤。
[0023] 本發(fā)明人通過深入研究VEGFR2乃至整個VEGFRs受體家族配體識別和受體活化的 機制，首次采用噬菌體展示技術篩選出富集人源化納米抗體并對其進行基因測序及蛋白表 達純化；進一步通過AlphaScreen技術篩選出與抗原具有較高結合力的納米抗體；得到了 具有更高親和力和良好抗腫瘤活性的人源納米抗體NTVl。通過表面等離子共振（SPR)技術 表征該抗體的動力學行為；細胞實驗驗證了其抑制血管內(nèi)皮細胞增殖能力及抑制血管新生 活性。本發(fā)明表達并優(yōu)化獲得親和力高且穩(wěn)定均一的VEGFR2納米抗體蛋白，成功研發(fā)人源 抗VEGFR2納米抗體藥物，開辟了靶向VEGFR2抗體的藥物研發(fā)的新領域，具有深遠的社會意 義和廣闊的臨床應用前景。并且，本發(fā)明為相關后續(xù)藥物研發(fā)提供了基礎，可以據(jù)此研發(fā)攜 帶化藥或者融合Fc的抗體以增加療效。
【附圖說明】
[0024] 圖1:顯示NTV(1-4)四種納米抗體氨基酸序列比對。將抗體的基因序列翻譯成氨 基酸序列，進行多序列比對。未標記的是互補決定區(qū)，標記的是框架區(qū)。
[0025] 圖2:顯示NTV(l-4)蛋白的表達純化。10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白純度， 標準分子量標在凝膠左側。從左到右分別為NTVl、NTV2、NTV3、NTV4。
[0026]圖 3=AlphaScreen檢測VEGFR2D3 和NTV(1-4)之間的反應。（A)AlphaScreen反 應示意圖，（B_E)NTV1、NTV2、NTV3、NTV4 與VEGFR2D3 反應的AlphaScreen檢測結果。圖 4: SPR分析NTVl和VEGFR2D3反應動力學。
[0027] 圖5 :NTV1對人臍靜脈細胞增殖的效應。
[0028] 圖6 :NTV1體外抑制HUVEC血管形成效應。
【具體實施方式】
[0029] 以下實施例和實驗例所用實驗儀器和實驗材料信息如下：
[0030] 試劑及試劑盒
[0031] 質粒小提試劑盒 百泰克
[0032]PCR產(chǎn)物回收試劑盒 百泰克
[0033] 瓊脂糖凝膠回收試劑盒 百泰克
[0034] 瓊脂糖生工
[0035]蛋白胨sigma
[0036] 酵母提取物sigma
[0037]Tris-basesigma
[0038]生物素 sigma
[0039]咪唑 sigma
[0040]內(nèi)切酶BamHlNEB
[0041]內(nèi)切酶NotlNEB
[0042]T4DNA連接酶Fermentas
[0043]Q5~HighFidelityDNApolymeraseNEB
[0044]麥芽糖 sigma
[0045]嗤菌體展不庫HuSdLTMCreativeBioLabs
[0046]輔助嗤菌體M13K07helperphageGEHealthcare
[0047]磁珠DyiUlbeads拉MyOne?StreptavidinCllifetechnologies
[0048]IPTG 生工
[0049]PEG8000 sigma
[0050]SDSsigma
[0051]Tween-20 國藥
[0052]BiotinCAPtureKitSeriesSGEHealthcare
[0053]AlphascreenHistidineDetectionKitPerkinElmer
[0054] 儀器設備
[0055]AKTAFPLC系統(tǒng)（GE)
[0056]NanoVuespectrophotometer(GE)
[0057]centrifuges5415R(Eppendorf)
[0058]SorvallRC12BPcentrifuge(Thermo)
[0059]avantiJ-26xp(BECKMANCOULTER)
[0060]Incubator/shakerfor2Lbacterialcultures(Thermo)
[0061] 層析冷柜（北京德天佑）
[0062]PCR machines(Eppendorf)
[006