3] 作為優(yōu)選，發(fā)酵的溫度為28~32°C，轉(zhuǎn)速為100~500rpm。
[0044] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，發(fā)酵的溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為200rpm。
[0045] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，發(fā)酵所用培養(yǎng)基為YH)培養(yǎng)基。
[0046] 作為優(yōu)選，YPD培養(yǎng)基配方為：葡萄糖10~200g/L，酵母粉5~15g/L，蛋白胨 15 ~25g/L。
[0047] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，Yro培養(yǎng)基還包括：碳酸鈣1~5g/L。
[0048] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，Yro培養(yǎng)基配方為：葡萄糖22g/L，酵母粉10g/L， 蛋白胨20g/L，碳酸f丐3g/L。
[0049] 在本發(fā)明提供的另一些實(shí)施例中，YH)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖110g/L，酵母粉IOg/ L，蛋白胨20g/L。
[0050] 本發(fā)明還提供了該釀酒酵母工程菌株的培養(yǎng)方法，該培養(yǎng)方法為：本發(fā)明釀酒酵 母工程菌株以乙醇為碳源進(jìn)行培養(yǎng)。
[0051] 作為優(yōu)選，在該培養(yǎng)方法中，培養(yǎng)的溫度為28~32°C，轉(zhuǎn)速為100~500rpm。
[0052] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，培養(yǎng)的溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為200rpm。
[0053] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，培養(yǎng)所用培養(yǎng)基為YPE培養(yǎng)基。
[0054] 作為優(yōu)選，YPE培養(yǎng)基配方為：乙醇10~50mL/L，酵母粉5~15g/L，蛋白胨15~ 25g/L〇
[0055] 優(yōu)選地，YPE培養(yǎng)基配方為：乙醇20mL/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。
[0056] 本發(fā)明還提供了該釀酒酵母工程菌株的馴化方法，該馴化方法為：
[0057] 將本發(fā)明釀酒酵母工程菌株在YPE液體培養(yǎng)基活化至少兩次后，再將菌株轉(zhuǎn)接到 YH)液體培養(yǎng)基中馴化1~3代。
[0058] 將馴化后的菌株，再轉(zhuǎn)接到Y(jié)H)液體培養(yǎng)基中可較第一代生長(zhǎng)明顯變快，消耗葡 萄糖速度變快。將馴化后的菌株保存到Y(jié)H)平板和甘油菌中，快速利用葡萄糖的能力不會(huì) 退化。
[0059] 本發(fā)明提供了一種釀酒酵母工程菌株及其制備方法、應(yīng)用、發(fā)酵培養(yǎng)方法。該釀酒 酵母工程菌株的rocI、PDC5、roC6、ADHl、ADH4基因被敲除，并插入LDH基因。本發(fā)明所述釀 酒酵母工程菌株不含乙醇代謝主要途徑，可以大量利用葡萄糖發(fā)酵積累乳酸，該菌株能夠 快速利用乙醇生長(zhǎng)。研究結(jié)果顯示：在葡萄糖（l〇〇g/L)為唯一碳源的YH)液體培養(yǎng)基中， 可產(chǎn)88g/L的乳酸，且全部為L(zhǎng)-乳酸，不產(chǎn)乙醇。在乙醇（15. 8g/L)為唯一碳源的液體培 養(yǎng)基YPE中，可快速生長(zhǎng)，不產(chǎn)乳酸。且發(fā)酵所用培養(yǎng)基成分簡(jiǎn)單、便宜。
【附圖說(shuō)明】
[0060] 圖1示菌株SyBE_Sc01020039的原始菌株敲除乙醇生成路徑和插入外源乳酸生成 途徑的示意圖；一分子葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑產(chǎn)生兩分子丙酮酸，并進(jìn)一步代謝生成乳酸；
[0061] 圖 2 不缺失產(chǎn)物Prom_pdc5-Ter_pdc5-Marke;r_URA3-〇RF_pdc5_f'不意圖；
[0062] 圖3不缺失產(chǎn)物Prom_pdc6-Ter_pdc6-Marke;r_URA3-〇RF_pdc6_f'不意圖；
[0063] 圖4不缺失產(chǎn)物Prom_adh4-Ter_adh4-Marke;r_URA3-〇RF_adh4_f'不意圖；
[0064] 圖 5 不缺失產(chǎn)物Prom_pdcl-〇RF_LDH-Ter_pdcl-Marke;r_URA3-〇RF_pdcl_f'不意 圖，其中乳酸脫氫酶基因LDH(NM_174099)來(lái)源于Bostaurus(cattle);
[0065] 圖 6 不缺失產(chǎn)物Prom_adhl-〇RF_LDH-Ter_pdcl-Marke;r_URA3-〇RF_pdcl_f' 不意 圖，其中乳酸脫氫酶基因LDH(NM_174099)來(lái)源于Bostaurus(cattle);
[0066] 圖7示丙酮酸脫羧酶基因F>DC5敲除原理示意圖；
[0067] 圖8不丙酬酸脫駿酶基因F1DCl敲除同時(shí)插入乳酸脫氣酶基因LDH不意圖；
[0068] 圖9表示目標(biāo)菌株SyBE_Sc01020039和野生型相關(guān)菌株的分子生物學(xué)驗(yàn)證電泳 圖；
[0069] 其中，alL:驗(yàn)證基因ADHl敲除同時(shí)LDH插入的條帶，是否完成、正確；
[0070] a4 :驗(yàn)證基因ADH4敲除的條帶是否正確；
[0071] plL:驗(yàn)證基因roCl敲除同時(shí)LDH插入的條帶，是否完成、正確；
[0072] p5 :驗(yàn)證基因PDC5敲除是否正確；
[0073] p6 :驗(yàn)證基因PDC6敲除是否正確；
[0074] 標(biāo)注WT的泳道：BY4741原始菌株，未做基因敲除；
[0075] 未做標(biāo)注的泳道：目標(biāo)菌株正確條帶；
[0076] 圖10示菌株SyBE_Sc01020039在以乙醇為唯一碳源的搖瓶發(fā)酵上的生長(zhǎng)曲線(xiàn)；
[0077] 圖11示菌株SyBE_Sc01020039在以乙醇為唯一碳源的搖瓶發(fā)酵的乙醇消耗曲 線(xiàn)；
[0078] 圖12示菌株SyBE_Sc01020039在以葡萄糖為唯一碳源的搖瓶發(fā)酵的葡萄糖消耗 曲線(xiàn)和乳酸生成曲線(xiàn)；
[0079] 圖13示菌株SyBE_Sc01020039在以高濃度葡萄糖為唯一碳源的搖瓶發(fā)酵的葡萄 糖消耗曲線(xiàn)和乳酸生成曲線(xiàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0080] 本發(fā)明公開(kāi)了一種釀酒酵母工程菌株及其制備方法、應(yīng)用、發(fā)酵培養(yǎng)方法，本領(lǐng)域 技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換 和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法 及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范 圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0081] 本發(fā)明提供的釀酒酵母工程菌株及其制備方法、應(yīng)用、發(fā)酵培養(yǎng)方法中所用菌株、 引物、DNA均可由市場(chǎng)購(gòu)得。
[0082] 下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：
[0083] 實(shí)施例1缺失產(chǎn)物的構(gòu)建
[0084] 1、合成外源基因
[0085] 據(jù)乳酸脫氫酶基因NM_174099序列，經(jīng)J-Cat優(yōu)化后人工合成其DNA。
[0086] 2、構(gòu)建缺失模塊
[0087] 以釀酒酵母BY4741菌株的基因組為模板，擴(kuò)增得到丙酮酸脫羧酶基因roCl、 PDC5、roC6以及乙醛脫氫酶基因ADH1、ADH4的啟動(dòng)子、終止子、ORF框各部分。各部分的擴(kuò) 增引物序列具體如下：
[0088] 表1擴(kuò)增引物序列
[0089]


[0092] 根據(jù)表1中rocs相關(guān)引物序列擴(kuò)增得到丙酮酸脫羧酶基因rocs的啟動(dòng)子、終止 子、營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記URA3和ORF框部分，將上述產(chǎn)物經(jīng)PCR反應(yīng)連接到一起得到缺失模塊ATOC5 如圖2所示。
[0093] 根據(jù)表1中roce相關(guān)引物序列擴(kuò)增得到丙酮酸脫羧酶基因roce的啟動(dòng)子、終 止子、營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記URA3和ORF框一部分，將上述產(chǎn)物經(jīng)PCR反應(yīng)連接到一起得到缺失模塊 ATOC6如圖3所示。
[0094] 根據(jù)表1中ADH4相關(guān)引物序列擴(kuò)增得到丙酮酸脫羧酶基因ADH4的啟動(dòng)子、終 止子、營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記URA3和ORF框一部分，將上述產(chǎn)物經(jīng)PCR反應(yīng)連接到一起得到缺失模塊 AADH4如圖4所示。
[0095] 根據(jù)表1中roCl相關(guān)引物序列擴(kuò)增得到基因roCl啟動(dòng)子、終止子、營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記Ura3 和ORF框一部分的片段，以L(fǎng)DH相關(guān)引物序列（SEQIDNO: 33、SEQIDNO: 34)擴(kuò)增得到乳 酸脫氫酶基因LDH的片段，將上述獲得的PCR產(chǎn)物片段，經(jīng)PCR反應(yīng)連接在一起，得到缺失 模塊ATOCl::LDH如圖5所示。
[0096] 根據(jù)表1中ADHl相關(guān)引物序列擴(kuò)增得到基因ADHl啟動(dòng)子、終止子、營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記Ura3 和ORF框一部分的片段，以L(fǎng)DH相關(guān)引物序列（SEQIDNO:43、SEQIDNO:44)擴(kuò)增得到乳 酸脫氫酶基因LDH的片段，將上述獲得的PCR產(chǎn)物片段，經(jīng)PCR反應(yīng)連接在一起，得到缺失 模塊AADHl::LDH如圖6所示。
[0097] 實(shí)施例2 :基因敲除菌株的構(gòu)建
[0098]1、接BY4741菌株在YH)培養(yǎng)基，30 °C過(guò)夜培養(yǎng)。
[0099] 2、轉(zhuǎn)接上述過(guò)夜的菌株的培養(yǎng)液到5ml新鮮YH)中，使初始0D6。。= 0. 1，繼續(xù)30°C 培養(yǎng)4-6小時(shí)，使培養(yǎng)液OD6。。達(dá)到0. 4-0. 6。
[0100] 3、轉(zhuǎn)化：用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，將上述得到的缺失模塊ATOC5轉(zhuǎn)化BY4741制成的感受 態(tài)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化后涂布在SC-Ura的平板，30°C培養(yǎng)。
[0101] 4、提取基因組驗(yàn)證：挑取轉(zhuǎn)化子，提取基因組做PCR驗(yàn)證標(biāo)簽，BY4741作為陰性對(duì) 照，條帶大小正確，表明缺失模塊同源重組正確，完成。
[0102] 5、彈掉營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記Ura3 :將驗(yàn)證正確轉(zhuǎn)化子在FoA劃線(xiàn)，彈掉營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記URA3。
[0103] 6、提取基因組驗(yàn)證：挑取在FoA平板上長(zhǎng)出的菌株，提取基因組進(jìn)行PCR，標(biāo)簽驗(yàn) 證，BY4741作為陰性對(duì)照，條帶大小正確，表明基因缺失成功。
[0104]7、將步驟5得到的驗(yàn)證正確菌株接到Y(jié)PD培養(yǎng)基，30°C過(guò)夜培養(yǎng)；重復(fù)步驟2-6繼 續(xù)轉(zhuǎn)化缺失模塊ATOC6。
[0105] 8、轉(zhuǎn)化：將得到的正確菌株逐次轉(zhuǎn)化HO質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后涂布在SC-Ura的平板，30°C 培養(yǎng)。
[0106] 9、提取基因組驗(yàn)證：挑取轉(zhuǎn)化子，提取基因組做PCR驗(yàn)證標(biāo)簽，有a型和alpha型 兩條條帶且大小正確，表明交配型改變正確，完成。
[0107] 10、將缺失模塊AADH4,AADHl::LDH，ATOCl::LDH逐次轉(zhuǎn)入步驟9獲得二倍體 菌株，重復(fù)步驟2-7,獲得五個(gè)基因都敲除的菌株。
[0108] 11、將步驟10獲得菌株在醋酸鉀平板上涂布，培養(yǎng)5天。
[0109] 12、將步驟11獲得孢子