一種枯草芽孢桿菌在處理制革廢水總氮中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種枯草芽孢桿菌QBacillus subtil is)在處理制革廢水總氮中的應(yīng)用。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]皮革業(yè)是高污染行業(yè)，隨著皮革工業(yè)產(chǎn)量的增加，制革工業(yè)排放的污染物也在不斷增加，制革廢水污染環(huán)境問(wèn)題日益突出。
[0004]由于制革工藝的特點(diǎn)，決定了制革廢水成分復(fù)雜、顏色深，總氮比較高?？偟?TN)包括廢水中的所有含氮化合物，即有機(jī)氮(蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸和尿素等)和無(wú)機(jī)氮(氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮)。眾所周知，水體中過(guò)多的氮能引起水體富營(yíng)養(yǎng)化，造成水質(zhì)惡化，魚類及其它生物大量死亡；此外，亞硝酸鹽可形成致癌物亞硝胺，危害人畜的生命健康；硝酸鹽氮可被還原為亞硝酸鹽氮；而氨氮會(huì)污染大氣，用含過(guò)量氨氮的廢水灌溉土壤時(shí)還會(huì)導(dǎo)致農(nóng)作物受到嚴(yán)重危害。
[0005]制革廢水中的總氮主要來(lái)自兩個(gè)方面:一是制革脫灰和軟化過(guò)程中要用到無(wú)機(jī)銨鹽，目前從成本和使用效果來(lái)看，還沒(méi)有可以全部替代無(wú)機(jī)銨鹽的脫灰劑；另一方面制革是以加工膠原纖維一一蛋白質(zhì)為主要原料的過(guò)程，大量的皮蛋白將被水解到廢水中，隨著廢水中蛋白質(zhì)的氨化，廢水中總氮特別是氨氮濃度迅速升高，這使得廢水中氨氮濃度很高，達(dá)到300-600mg/L，有時(shí)候甚至出現(xiàn)廢水越處理氨氮濃度越高的現(xiàn)象。在國(guó)家環(huán)境保護(hù)部于2013年12月27日正式發(fā)布的《制革及毛皮加工工業(yè)水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 30486—2013)中，明確新設(shè)置了總氮控制指標(biāo)，規(guī)定了對(duì)污染物總氮的排放限值，對(duì)制革現(xiàn)有企業(yè)(2014.7.1?2015.12.31)、現(xiàn)有企業(yè)(自2016年I月I日起)、新建企業(yè)和特別保護(hù)地區(qū)的總氮直接排放限值分別為70、50、50、20mg/L。由此可見(jiàn)，對(duì)制革廢水中總氮的治理已不容忽視。
[0006]長(zhǎng)期以來(lái)，人們較重視對(duì)氨氮的處理，對(duì)制革廢水中總氮的治理在之前并沒(méi)有引起太多關(guān)注。目前控制制革廢水中總氮的方法主要有:(1)清潔化生產(chǎn)，即控制源頭。近幾年學(xué)者們致力于開(kāi)發(fā)清潔化脫灰和鞣制工藝，以盡可能減少?gòu)U水中總氮的含量。(2)生化處理技術(shù)。近幾年來(lái)研究者們探索了去除制革廢水中總氮的不同生化方法，包括厭氧-好氧(A/0)工藝、生物膜反應(yīng)器(MBR)方法等。為了使制革廢水中的總氮能達(dá)到新的國(guó)家排放標(biāo)準(zhǔn)，在采用清潔生產(chǎn)工藝、從源頭降低污染物總氮的同時(shí)，需要尋找有效的廢水處理新技術(shù)。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種枯草芽孢桿菌(SaciWiAs1 sub tills)的應(yīng)用，所述枯草芽孢桿菌保藏號(hào)為CCTCC M 2014512，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期是2014年10月26日，通過(guò)從枯草芽孢桿菌菌種中提取出生物絮凝劑，并用該生物絮凝劑處理制革廢水中的總氮，綠色環(huán)保、不產(chǎn)生二次污染等，消除制革生產(chǎn)中產(chǎn)生的高濃度總氮廢水對(duì)環(huán)境的污染，并構(gòu)建清潔的制革廢水中總氮處理新技術(shù)。
[0009]解決以上技術(shù)問(wèn)題的一種枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:保藏號(hào)為CCTCC M2014512，所述枯草芽孢桿菌應(yīng)用于降低制革廢水中總氮。
[0010]所述枯草芽孢桿菌由制革廠的活性污泥中培育和馴化而得。
[0011]所述培育和馴化步驟如下:
(I)菌種的富集培養(yǎng):
采集制革廠的活性污泥接種至已滅菌并冷卻的LB培養(yǎng)基中，污泥與培養(yǎng)基的培養(yǎng)比例是體積比約1:8-12，于28-32°(:搖床培養(yǎng)46-5011，LB培養(yǎng)基配制如下:蛋白胨8_12g，酵母膏 4-7g，NaCl 8-12g，加蒸餾水到 100mL, ρΗ6.8-7.2，115_125°C滅菌 15_25min ;搖床轉(zhuǎn)速是 100r/min。
[0012](2)菌種的馴化:
將5mL富集培養(yǎng)菌液接種于10mL含有制革廢水的LB培養(yǎng)基中28_32°C振蕩培養(yǎng)45-50h，并逐漸增加制革廢水的量至40 mL、60 mL、80 mL，逐級(jí)馴化；逐級(jí)馴化，其目的是為了使培養(yǎng)的菌種能夠適應(yīng)制革廢水的高濃度總氮。
[0013]通過(guò)步驟(I)培養(yǎng)后的活性污泥，即為富集培養(yǎng)菌液。
[0014]馴化過(guò)程中菌落是否馴化成功，是通過(guò)檢測(cè)每一級(jí)馴化時(shí)培養(yǎng)前后含有制革廢水的LB培養(yǎng)基的總氮去除率是否始終維持在較高水平而定的，若總氮去除率始終維持在較高水平，則可進(jìn)行下一級(jí)馴化；在好氧反應(yīng)器中進(jìn)行馴化；馴化培養(yǎng)基都為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。
[0015]③菌種的分離:
通過(guò)稀釋平板法，以固體LB培養(yǎng)基為分離培養(yǎng)基，從已馴化的菌液中分離出各種細(xì)菌，并對(duì)各菌株進(jìn)行純化。
[0016]稀釋平板法。即:用無(wú)菌移液管吸取20mL已經(jīng)馴化好的活性污泥，放入帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振蕩，將各種菌的細(xì)胞充分分散(用顯微鏡觀察，細(xì)胞呈單細(xì)胞)。用無(wú)菌吸管從中吸取ImL菌體懸浮液加入盛有9mL的大試管中充分混勻，然后用無(wú)菌吸管從此試管中吸取11^加入另一盛有91^無(wú)菌水的試管中，混合均勻，依此類推制成10_1、10_2、10_3、10_ 4UO- 5UO- 6UO- 7不同稀釋度的菌體懸浮液。然后用無(wú)菌移液管分別吸取不同稀釋度的稀釋液于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，再將已滅菌并冷卻至45?50°C左右的LB固體培養(yǎng)基傾入到各無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，傾入培養(yǎng)基約為15mL。之后將培養(yǎng)皿在無(wú)菌操作臺(tái)上輕輕前后左右轉(zhuǎn)動(dòng)，使稀釋的菌懸液與融化的瓊脂培養(yǎng)基混合均勻，混勻后靜置。待平板冷卻后，將平板倒置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I?2天。最后將培養(yǎng)后長(zhǎng)出的單個(gè)菌落分別挑取少許細(xì)胞接種到LB培養(yǎng)基的試管斜面上。
[0017]純化的步驟:將每個(gè)斜面中接種的菌株，通過(guò)前述稀釋平板法分離步驟，反復(fù)分離菌種，直至所分離的菌種為純培養(yǎng)，即菌苔長(zhǎng)出后，其菌落特征一致即可。
[0018]優(yōu)化方案，本發(fā)明中還有生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選，所述培育和馴化還包括生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選，如以下步驟:
(I)初篩
將分離純化出的枯草芽孢桿菌菌株接種于絮凝培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，將培養(yǎng)液離心，取上清液進(jìn)行絮凝活性的初篩，即:取2 mL培養(yǎng)液加入100 mL 4 g/L高嶺土懸浮液中，同時(shí)以不加培養(yǎng)液的高嶺土懸浮液進(jìn)行對(duì)照，觀察，以是否出現(xiàn)絮凝來(lái)判斷是否具有絮凝活性從而進(jìn)行初篩，若絮凝，則初步判定有產(chǎn)生物絮凝劑的能力，需進(jìn)一步檢測(cè)培養(yǎng)液中絮凝劑的絮凝活性大??；絮凝培養(yǎng)基配制如下=NaNO3 1-3 g，KCl 0-11 g, K2HPO4 0.5-1.5 g,MgSO40.3-0.7 g, FeSO4 0.01 g，蔗糖 27-32 g和蒸餾水 1L，除FeSO4 外，其余原料均在 115_125°C滅菌15-25 min，待滅完菌冷卻后，將FeSO4溶解于滅菌后的蒸餾水中，過(guò)濾，再將過(guò)濾后的FeSO4溶液加入該培養(yǎng)基內(nèi)；
(2)復(fù)篩
將初篩出的具有絮凝能力的菌株分別接種于絮凝培養(yǎng)基中培養(yǎng)，45-50h后，以絮凝率的大小作為衡量菌株產(chǎn)絮凝劑能力的大小，從中選出具有生物絮凝劑產(chǎn)生的枯草芽孢桿菌。篩選出的枯草芽孢桿菌既能產(chǎn)絮凝劑，有去除污染物的能力。
[0019]本發(fā)明中一種枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于:利用枯草芽孢桿菌處理制革廢水總氮的方法包括以下步驟:
(1)培養(yǎng)基配制:NaNO31.5-2.5g, KCl 0_llg，K2HPO4 0.6-1.2 g，MgSO4 0.3-0.7 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，蔗糖28-32 g和蒸餾水1L，除FeSO4外，其余原料均在115_125°C滅菌15-25min,待滅完菌冷卻后，將FeSO4溶解于滅菌后的蒸餾水中，用滅菌過(guò)濾器過(guò)濾溶解的FeSO 4，用無(wú)菌移液管吸取過(guò)濾后的FeSO4溶液加入該培養(yǎng)基內(nèi)；
(2)發(fā)酵:將枯草芽孢桿菌菌種接種至裝有50mL培養(yǎng)基的250mL搖瓶，放在轉(zhuǎn)速為180r/min的搖床內(nèi)，于32-38°C條件下振蕩培養(yǎng)45-50h ;培養(yǎng)后的菌種再接種至裝有10mL培養(yǎng)基的250mL錐形瓶，然后于32-38°C條件下振蕩培養(yǎng)24?68h得發(fā)酵液，菌種與培養(yǎng)基的接種量比例是體積比1:8-12 ;發(fā)酵液是指步驟(2)經(jīng)過(guò)培養(yǎng)24?68h的培養(yǎng)液。
[0020](3)生物絮凝劑的提取:將發(fā)酵液放入轉(zhuǎn)速為5000-10000r/min的離心機(jī)中，離心lOmin，收集上清液，然后