地塞米松，5 μ g/L 的胰島素(INSULIN)，40 μ g/ml 的腺嘌呤，0.25nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 維甲酸。
[0031]實(shí)施例4:
步驟一、脂肪層的構(gòu)建
1、P6代的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)消化，于800rpm/min條件下離心5min。用含體積比10%胎牛血清(FBS)的a -MEM培養(yǎng)基中重懸，每孔0.25Ε6密度接種至Transwell小室，小室內(nèi)液量150 μ 1,5% CO2、37 °C孵箱中培養(yǎng)；
2、24h后更換培養(yǎng)液，棄去小室內(nèi)外的a-MEM培養(yǎng)基，加入成脂誘導(dǎo)液，保持小室內(nèi)液量150 μ 1，5% C02、37°C孵箱中培養(yǎng)5d，每隔2d換液；
3、5d后，重復(fù)步驟l，24h后更換小室內(nèi)外培養(yǎng)液為成脂誘導(dǎo)液，保持小室內(nèi)液量150 μ 1,5% C02、37°C孵箱中培養(yǎng)4d，每隔24h更換小室內(nèi)液體，加液量同上。
[0032]成脂誘導(dǎo)液組成:a -MEM培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)液，其中添加體積比為10%的胎牛血清(FBS)，吲哚美辛 0.05mg/ml，IBMX 0.2mg/ml，胰島素 0.02 mg/ml，地塞米松 0.1 μ g/ml。
[0033]步驟二、真皮層的構(gòu)建:
1、P6代成纖維細(xì)胞消化后，于800rpm/min條件下離心5min。在含有35μ g/ml Vc以及體積比為10%的胎牛血清(FBS)的a -MEM培養(yǎng)基中重懸，以每孔0.25Ε6密度接種至步驟一的脂肪層，保證小室內(nèi)液量150 μ 1,5% C02、37°C孵箱中培養(yǎng)；
2、24h后，重復(fù)步驟1，在5%C02、37°C孵箱中培養(yǎng)2d，每隔24h換液，保證小室內(nèi)液量150 μ 10
[0034]步驟三、表皮層的構(gòu)建:
1、Ρ5代表皮細(xì)胞培養(yǎng)融合率達(dá)60%左右，消化后于800rpm/min條件下離心8min，用構(gòu)建培養(yǎng)液SKcl重懸，以3.0E5/孔的細(xì)胞密度接種至步驟二的真皮層中。其中，SKcl階段為液下培養(yǎng)方式，保證小室內(nèi)液量150 μ 1，于5% C02、37°C孵箱中培養(yǎng)，每24h換液一次；
2、培養(yǎng)3d后，更換成構(gòu)建培養(yǎng)液SKc2培養(yǎng)液，并進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，將步驟I中Transwell小室的培養(yǎng)液吸去，保持人工皮膚表面的干燥，隨后5% C02、37°C孵箱中培養(yǎng)3d，每24h換液一次；
3、3d后，更換成構(gòu)建培養(yǎng)液SKc3，并進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，5%C02、37°C孵箱中培養(yǎng)3d，每24h換液一次；
4、3d后，更換成構(gòu)建培養(yǎng)液SKc4，并進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，5%C02、37°C孵箱中培養(yǎng)2d，每24h換液一次；
不同構(gòu)建用液的所含成分具體如下:
構(gòu)建基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM 構(gòu)建培養(yǎng)液SKcl是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比分別為10%的胎牛血清(FBS)，0.5ng/ml 的 EGF，0.25 μ g/ml 的地塞米松，15 μ g/L 的胰島素(INSULIN)，25 μ g/ml 的腺嘌呤，0.1nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 維甲酸；
構(gòu)建培養(yǎng)液SKc2是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比分別為10%的胎牛血清(FBS)，添加0.25 mM 的 CaC12，0.5 ng/ml 的 EGF，55 μ g/ml 的 Vc，0.25 μ g/ml 的地塞米松，15 μ g/L的胰島素(INSULIN)，25 μ g/ml 的腺嘌呤，0.1nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 維甲酸；構(gòu)建培養(yǎng)液SKc3是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比分別為10%的胎牛血清(FBS)，添加0.5mM 的 CaC12，0.5 ng/ml 的 EGF，55 μ g/ml 的 Vc，0.25 μ g/ml 的地塞米松，15 μ g/L 的胰島素(INSULIN)，40 μ g/ml 的腺嘌呤，0.2nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 維甲酸；培養(yǎng)液SKc4是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比為10%的胎牛血清(FBS)，添加ImM的CaC12，0.5ng/ml 的 EGF，0.25 μ g/ml 的地塞米松，15 μ g/L 的胰島素(INSULIN)，40 μ g/ml 的腺嘌呤，0.2nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 維甲酸。
[0035]由此，不難看出，以上各實(shí)施例所提供的用于體外替代測(cè)試的全層皮膚是含有脂肪層的人工皮膚，具有三層皮膚結(jié)構(gòu)，自上而下分別為表皮層，真皮層，脂肪層。表皮層由表皮細(xì)胞生發(fā)復(fù)層化組成，厚度約為150?200Mm ;真皮層由成纖維細(xì)胞及其胞外基質(zhì)組成，厚度約40.0?60.0Mffl ;脂肪層由脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)而成的脂肪細(xì)胞及胞外基質(zhì)組成，厚度約為10.0?20.0Mm。其中，表皮層通過表皮細(xì)胞在特殊的氣液面培養(yǎng)條件下(即以上各實(shí)施例所述的培養(yǎng)方式)生發(fā)成類似正常人體皮膚的表皮樣結(jié)構(gòu)；真皮層構(gòu)建時(shí)不添加任何外源支架結(jié)構(gòu)，通過多次細(xì)胞接種法分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，構(gòu)成厚度約40.0?60.0Mffl的真皮層厚度，除保證同人體正常皮膚結(jié)構(gòu)的高度相似，還可滿足表皮層生發(fā)時(shí)所需營(yíng)養(yǎng)；脂肪層是在三維培養(yǎng)條件下，將脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)過成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)，使之誘導(dǎo)分化為可形成脂滴的脂肪細(xì)胞，同時(shí)細(xì)胞通過增殖及胞外基質(zhì)分泌作用復(fù)層化形成。
[0036]而以上各實(shí)施例提供的用于體外替代測(cè)試的全層皮膚的制備過程具體通過以下步驟體現(xiàn):
步驟一、脂肪層的構(gòu)建
1.1)、將P3?P8代的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞消化后，于800?1000 rpm/min條件下離心5?8min。在含體積比為5?10%的胎牛血清(FBS)的a -MEM培養(yǎng)基中重懸，以每孔0.12Ε6?0.25Ε6密度接種至Transwell小室，保持小室內(nèi)液量150?200 μ 1，在4.5%?
5.5% C02、37±1°C的孵箱中培養(yǎng)；
1.2)、18?24h后更換培養(yǎng)液，棄去小室內(nèi)外的a -MEM培養(yǎng)基，加入成脂誘導(dǎo)液，保持小室內(nèi)液量150?200 μ 1，在4.5%-5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培養(yǎng)5?7d，每隔2?3d換液；
1.3)、5?7d后，重復(fù)步驟1.1)、，18?24h后更換小室內(nèi)外培養(yǎng)液為成脂誘導(dǎo)液，保持小室內(nèi)液量150?200 μ 1，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培養(yǎng)2?4d，每隔18?24h更換小室內(nèi)液體，加液量同上；
成脂誘導(dǎo)液組成:a -MEM培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)液，其中添加體積比為5?10%的胎牛血清(FBS)，吲哚美辛 0.01 ?0.05mg/ml，ΙΒΜΧ0.1 ?0.5mg/ml，胰島素 0.01 ?0.05 mg/ml，地塞米松 0.1 ~ 0.8 μ g/ml O
[0037]本步驟一是構(gòu)建含脂肪層的全層皮膚的關(guān)鍵步驟。本步驟采用從脂肪組織中提取的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞作為脂肪層的種子細(xì)胞。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞首先易獲取且不易造成繼發(fā)缺損或者感染。從整形美容外科患者的腹部、上臂、大腿、臀部等部位抽出的脂肪組織均可分離；其次，從以上方式獲得的脂肪組織數(shù)量較大，可分離大量的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；最后，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞在脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)液的誘導(dǎo)作用下同其它來源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比具有更高的分化率。在上述步驟中，采用脂肪層的兩次接種，這樣處理的優(yōu)勢(shì)是保證在短期培養(yǎng)過程中脂肪層具有一定的結(jié)構(gòu)性，即能夠達(dá)到10.0?20.0Mffl厚度；其次首次接種細(xì)胞后，通過成脂誘導(dǎo)液的培養(yǎng)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞開始向脂肪細(xì)胞分化并形成脂滴結(jié)構(gòu)。
[0038]脂滴(Lipid Droplet)是脂肪細(xì)胞的主要成分，占據(jù)了脂肪細(xì)胞的大部分空間，月旨滴不僅是脂肪結(jié)構(gòu)性的指證，也是脂肪細(xì)胞具有功能性的標(biāo)志。因此被認(rèn)為是脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成功的指標(biāo)。在出現(xiàn)脂滴結(jié)構(gòu)后進(jìn)行第二次脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的接種，底層出現(xiàn)脂肪細(xì)胞的脂肪層所形成的微環(huán)境能夠加速二次接種細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化，因此在短時(shí)間內(nèi)可形成含有大量脂滴的脂肪層。
[0039]步驟二、真皮層的構(gòu)建:
2.1)、P6?PlO代成纖維細(xì)胞消化后，于800?1000 rpm/min條件下離心5?8min。在含有25?75 μ g/ml Vc以及體積比為5?10%的胎牛血清(FBS)的a -MEM培養(yǎng)基中重懸，以每孔0.12Ε6?0.25Ε6密度接種至步驟一的脂肪層，保證小室內(nèi)液量150?200 μ 1，
4.5% ?5.5% C02、37±1°C孵箱中培養(yǎng)；
2.2)、18?24h后，重復(fù)步驟2.1)、，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C孵箱中培養(yǎng)2?4d，每隔18?24h換液，保證小室內(nèi)液量150?200 μ I。
[0040]步驟二實(shí)現(xiàn)了真皮層無外源性支架的構(gòu)建，通過成纖維細(xì)胞自分泌作用獲得胞外基質(zhì)，形成真皮層骨架結(jié)構(gòu)。
[0041]2013年，國(guó)外學(xué)者David Janson只接種一次成纖維細(xì)胞，經(jīng)過3周培養(yǎng)形成真皮層結(jié)構(gòu)，此過程培養(yǎng)周期長(zhǎng)，且培養(yǎng)要求較高。
[0042]因此使用真皮層成纖維細(xì)胞的兩次接種法，一方面人工縮短真皮層構(gòu)建周期，快速構(gòu)建真皮層結(jié)構(gòu)，另一方面避免真皮層長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)時(shí)因胞外基質(zhì)分泌，細(xì)胞受到機(jī)械牽拉所帶來的收縮問題。在培養(yǎng)過程中添加一定濃度的Vc，刺激成纖維細(xì)胞對(duì)胞外基質(zhì)的分泌，促進(jìn)真皮層結(jié)構(gòu)形成。
[0043]步驟三、表皮層的構(gòu)建:
3.1)、P4?P8代表皮細(xì)胞培養(yǎng)融合率達(dá)60?70%左右時(shí)，于800?1000 rpm/min條件下離心6?8min，用構(gòu)建培養(yǎng)液SKcl重懸，以1.5?3.0E5/孔的細(xì)胞密度接種至步驟二的真皮層中。其中，SKcl階段為液下培養(yǎng)方式，保證小室內(nèi)液量150?200 μ 1，于4.5%?
5.5% C02、37±1°C孵箱中培養(yǎng)，每18?24h換液一次；
3.2)、培養(yǎng)2?3d后，更換成構(gòu)建培養(yǎng)液SKc2，并進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，將步驟I中Transwell小室的培養(yǎng)液吸去，保持人工皮膚表面的干燥，隨后于4.5%?5.5% C02、37±1°C的孵箱中培養(yǎng)2?3d，每18?24h換液一次；
3.3)、2?3d后，更換成SKc3構(gòu)建培養(yǎng)液，并進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，在4.5%?5.5% CO2,37±1°C的孵箱中培養(yǎng)2?3d，每18?24h換液一次；
3.4)、2?3d后，更換成SKc4構(gòu)建培養(yǎng)液，并進(jìn)行氣液面培養(yǎng)，在4.5%?5.5% CO2,37±1°C的孵箱中培養(yǎng)I?2d，每18?24h換液一次； 不同構(gòu)建用液的所含成分具體如下:
構(gòu)建基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM，
培養(yǎng)液SKcl是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比為5?10%的胎牛血清(FBS)，0.1?0.5ng/ml 的 EGF，0.1 ?0.8 μ g/ml 的地塞米松，3 ?25 μ g/L 的胰島素(INSULIN)，15 ?45 μ g/ml 的腺嘌吟，0.1 ?0.5nM 的 Thyroxine (T3)，4 ?10 μ g/ml 的維甲酸。
[0044]培養(yǎng)液SKc2是在DMEM培養(yǎng)液中添加體積比為5?10%的胎牛血清(FBS)，添加0.25 ?0.5 mM 的 CaC12，0.1 ?0.5 ng/ml 的 EGF，25 ?75 μ g/ml 的 Vc，0.1 ?0.8 μ g/ml的地塞米松，3?25 μ g/L的胰