inA)購自英國PeproTech公司，產(chǎn)品 目錄號為120-14。維甲酸購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為R2625。骨形成蛋白7(bone morphogeneticprotein7，BMP7)購自PeproTech公司，產(chǎn)品目錄號為 120-03。
[0022] 維甲酸和activinA均為細胞分化過程中重要的誘導因子，在多種細胞的分化發(fā) 育中起著重要的作用，在誘導過程中，通過添加不同的細胞因子及細胞因子組合，其共同作 用于干細胞，誘導干細胞向各種細胞分化。其中在之前公開的培養(yǎng)中，雖然包含這些成分， 但是并不限于這些成分，并且使用濃度與本專利申請培養(yǎng)基使用濃度及使用方法均不一 致。后腎發(fā)育過程中，在BMP7作用下后腎間充質(zhì)細胞與輸尿管芽接觸并相互聚集，促進后 腎間充質(zhì)細胞的生存。同時BMP7也參與調(diào)控足細胞的發(fā)育，是腎臟發(fā)育的重要誘導因子。
[0023] 所述培養(yǎng)基中全部成分都為誘導必須，其中誘導培養(yǎng)基1使用的維甲酸濃度是培 養(yǎng)基2維甲酸使用濃度的100倍，首先使用高濃度的維甲酸與activinA聯(lián)合誘導3天，有 效的誘導脂肪來源的間充質(zhì)干細胞向腎臟足細胞前體細胞分化，而后期低濃度的維甲酸， 以及BMP7與activinA聯(lián)合作用6天有效的誘導細胞發(fā)生間介上皮轉(zhuǎn)化并且進一步分化 為成熟的腎臟足細胞。
[0024] 通過本發(fā)明的方法，間充質(zhì)干細胞經(jīng)過兩步誘導法可在體外獲得腎臟足細胞，細 胞可表達足細胞特異性基因，并且最后獲得腎臟足細胞。
[0025] 本發(fā)明的誘導培養(yǎng)方法，適合于各種脂肪來源的間充質(zhì)干細胞，該誘導培養(yǎng)方法 無病毒導入、易操作、效率高。特別地，本發(fā)明的方法能夠在體外較短的誘導時間內(nèi)獲得大 量分化成熟、表型均一的腎臟足細胞，獲得的足細胞表達裂孔隔膜相關蛋白分子，對于維持 腎小球裂孔隔膜的結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用。本發(fā)明方法得到的腎臟足細胞為治療微小病 變性腎小球腎炎、局灶節(jié)段性腎小球硬化、膜性腎病、糖尿病腎病等足細胞相關疾病提供了 實驗依據(jù)和臨床研究證據(jù)，為細胞移植治療提供了新的途徑。
【附圖說明】
[0026] 圖1為人間充質(zhì)干細胞（腎臟足細胞的種子細胞）的形態(tài)。
[0027] 圖2為人間充質(zhì)干細胞（腎臟足細胞的種子細胞）的免疫表型檢測結(jié)果。
[0028] 圖3為人間充質(zhì)干細胞體外分化得到的腎臟足細胞的形態(tài)。
[0029] 圖4為人間充質(zhì)干細胞體外分化得到的腎臟足細胞的實時定量PCR檢測結(jié)果。
[0030] 圖5A-圖5F為人間充質(zhì)干細胞體外分化得到的腎臟足細胞的免疫細胞熒光染色 檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0031] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結(jié)果取平 均值。
[0032] 青霉素、鏈霉素和胰蛋白酶-EDTA購自GIBCO公司。Trizol購自美國Invitrogen 公司，OligodT、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶、dNTP和RNA酶抑制劑購自日本Takara 公司。
[0033] 山羊抗人WTl重組抗體、綿羊抗人N印hrin重組抗體購自美國R&D公司。兔抗人 Podocin多克隆抗體購自英國Abcam公司。AlexaFluor555驢抗綿羊IgG抗體、Alexa Fluor555驢抗山羊IgG抗體購自美國MolecularProbe公司、異硫氰酸標記的雞抗兔IgG 抗體購自美國SantaCruz公司。
[0034]HBSS緩沖液：NaCl8g/L、KCl0?40g/L、NaHCO3O. 35g/L、Na2HPO40?06g/L、KH2PO4 0.06g/L〇
[0035] 實施例I、培養(yǎng)基的制備
[0036]DMEM/F12培養(yǎng)基（又稱DF12培養(yǎng)基）購自GIBCO公司。胎牛血清（FBS)購自 GIBCO公司。人活化素A(activinA)購自英國PeproTech公司，產(chǎn)品目錄號為120-14。維 甲酸購自Sigma公司，產(chǎn)品目錄號為R2625。骨形成蛋白7(bonemorphogeneticprotein7， BMP7)購自P印roTech公司，產(chǎn)品目錄號為120-03。
[0037] 培養(yǎng)基1由DMEM/F12培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基1中的濃度如 下：體積濃度為2%的胎牛血清、lOng/mLactivinA和105mol/L維甲酸。
[0038] 培養(yǎng)基2由DMEM/F12培養(yǎng)基和溶質(zhì)組成；所述溶質(zhì)及其在培養(yǎng)基2中的濃度如 下：體積濃度為2%的胎牛血清、lOng/mLactivinA和107mol/L維甲酸、20ng/mlBMP7。
[0039] 實施例2、腎臟足細胞的誘導培養(yǎng)
[0040] -、制備第3代間充質(zhì)干細胞
[0041] 1、無菌收集成人吸脂術后脂肪組織（來源為人），在生物安全柜中，用含有青霉素 和鏈霉素的細胞洗滌液清洗2次，去除血細胞及麻藥，800rpm離心3min。
[0042] 2、將脂肪組織轉(zhuǎn)至新的50ml離心管內(nèi)，加入0. 05%膠原酶P消化組織，于37°C恒 溫培養(yǎng)震蕩器震蕩30min。
[0043] 3、消化后的脂肪組織100目篩網(wǎng)過濾并收集濾液，室溫1200rpm離心10分鐘，收 集細胞。
[0044] 4、將步驟3的細胞在37°C、5%C02、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，當 細胞達70% -80%匯合時，用D-Hank's液洗2遍，用lg/L胰蛋白酶（Gibco公司）常規(guī)消 化，細胞按照1 :3進行傳代，得到第1代間充質(zhì)細胞。
[0045] 5、將第1代間充質(zhì)細胞在37°C、5%C02、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中進行培 養(yǎng)，達70% -80%匯合，用D-Hank's液洗2遍，用lg/L胰蛋白酶（Gibco公司）常規(guī)消化， 細胞按照1 :3進行傳代，得到第2代間充質(zhì)細胞。
[0046] 6、將第2代間充質(zhì)細胞在37°C、5%C02、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中進行培 養(yǎng)，達70% -80%匯合，用D-Hank's液洗2遍，然后用lg/L的胰蛋白酶（Gibco公司）常規(guī) 消化，室溫1200rpm離心6分鐘，收集細胞。
[0047] 7、將步驟6的細胞在37°C、5%C02、空氣相對濕度為95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-6小 時，待細胞貼壁后棄除培養(yǎng)基，用D-Hank's洗2遍，記作第3代間充質(zhì)干細胞。
[0048] 二、采用培養(yǎng)基組合進行誘導培養(yǎng)
[0049] 1、第一階段的培養(yǎng)
[0050] (1)在6孔板中加入培養(yǎng)基1，每孔2ml。
[0051] (2)在步驟⑴的6孔板中接種第3代間充質(zhì)干細胞（使其在培養(yǎng)基中的濃度為 5XlO5個/ml)，在37°C、5 %C02、空氣相對濕度為95 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天（每1.5天吸 棄上清并加入2ml新的培養(yǎng)基1)。
[0052] 2、第二階段的培養(yǎng)
[0053]吸棄步驟1的6孔板中的上清，加入培養(yǎng)基2，每孔2ml，在37°C、5 %C02、空氣相對 濕度為95 %的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6天（每2天吸棄上清并加入2ml新的培養(yǎng)基2)，室溫1200rpm 離心5分鐘，收集細胞（沉淀）。
[0054] 三、誘導效果的鑒定
[0055] 1、第3代間充質(zhì)干細胞的免疫表型測定
[0056]步驟一得到的第3代間充質(zhì)干細胞的細胞形態(tài)見圖1。
[0057] 用間接免疫熒光法檢測第3代間充質(zhì)干細胞的表型，用異硫氰酸熒光素（FITC)標 記的小鼠抗人⑶29、⑶34、⑶44、⑶105、⑶106、HLA-DR和Flk-I抗體（抗體均購自BD公 司）標記后進行流式檢測，流式細胞儀為ACOJRIC6(BectonDickinson)。
[0058] 結(jié)果見圖2,橫坐標表示細胞熒光強度，縱坐標表示細胞數(shù)；Pl表示所選細胞群 體。表型結(jié)果顯示，第3代間充質(zhì)干細胞的⑶29、⑶44、⑶105、Flk-l均為陽性，⑶31、⑶34、 CD106和HLA-DR分子均為陰性。
[0059] 2、人間充質(zhì)干細胞誘導分化為腎臟足細胞的鑒定
[0060] (1)形態(tài)鑒定
[0061] 在培養(yǎng)基1中培養(yǎng)3天后細胞達80% -90%匯合，培養(yǎng)過程中細胞的形態(tài)變化如 下：成纖維細胞樣的人間充質(zhì)干細胞經(jīng)過3天的誘導后，細胞形態(tài)就出現(xiàn)了明顯的變化，誘 導第3天細胞變大并且變得扁平；在培養(yǎng)基2中繼續(xù)培養(yǎng)6天，細胞形態(tài)進一步發(fā)生變化， 在誘導的第9天，可見細胞較第