體外誘導(dǎo)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞分化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種體外誘導(dǎo)脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì) 胞（ADSCs)向成熟肝細(xì)胞（iH印s)分化的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝臟是一個(gè)調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程的關(guān)鍵器官。肝臟疾病，如爆發(fā)性肝損傷，是導(dǎo)致死 亡的重要原因。原位肝移植（OLT)是目前治療終末期肝臟疾病的唯一方法，但由于免疫排 斥等副作用及其肝臟供體的短缺限制了肝移植的臨床應(yīng)用。肝細(xì)胞移植是治療肝功能不全 的整體肝移植的替代療法；雖然原代肝細(xì)胞可以從供體肝臟中分離得到，但每次移植需要 1~5XIO9個(gè)肝細(xì)胞，這就需要獲得大量的供體肝或大量體外擴(kuò)增原代肝細(xì)胞。供體肝臟 的缺乏和原代肝細(xì)胞體外擴(kuò)增困難等原因使得獲得充足的可用于細(xì)胞治療的肝細(xì)胞非常 困難。為了解決目前這種窘境，迫切需要可快速產(chǎn)生大量肝細(xì)胞的新方法。
[0003] 過(guò)去幾年，發(fā)現(xiàn)了多種可用于治療肝臟疾病的肝外細(xì)胞群，其中具有多向分化潛 能和半無(wú)限增殖能力的間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs)就是一種重要的具有潛在應(yīng)用價(jià)值的細(xì)胞。 間充質(zhì)干細(xì)胞可從骨髓、脂肪、臍帶血、羊膜液、頭皮、胎盤(pán)等多種組織中獲得。其中，脂肪來(lái) 源的MSCs(ADSCs)被認(rèn)為是最有應(yīng)用前景的一類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞，其在脂肪組織的占比介于 I:100到I:500之間，遠(yuǎn)高于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓中所占比例，在再生醫(yī)學(xué)中有良好的 應(yīng)用前景。ADSCs來(lái)源充足，易得到，創(chuàng)傷小，可取材于患者自身的脂肪組織，這樣就避免了 免疫排斥反應(yīng)，也解決了倫理問(wèn)題等的障礙。已有研究表明ADSCs在體外具有誘導(dǎo)分化成 肝細(xì)胞的潛力。
[0004]目前的技術(shù)由ADSCs向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化都需要大約1個(gè)月的時(shí)間，使得這些誘導(dǎo) 分化方法并不適用于實(shí)際臨床應(yīng)用。而臨床應(yīng)用需要盡可能縮短體外誘導(dǎo)分化的時(shí)間。因 此，開(kāi)發(fā)新的能在短時(shí)間內(nèi)將ADSCs高效地誘導(dǎo)成為成熟肝細(xì)胞（iH印s)的方法是本領(lǐng)域 的一個(gè)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要求解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有ADSCs誘導(dǎo)成為iHeps的方法耗時(shí)長(zhǎng)，效率低 的缺陷。
[0006] 本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是提供一種新的體外誘導(dǎo)ADSCs向iHeps分化的 方法。該方法包括以下步驟：
[0007]a、從離體脂肪組織中分離出ADSCs;
[0008]b、體外誘導(dǎo)ADSCs向iHeps分化，誘導(dǎo)分化過(guò)程分為3個(gè)階段：
[0009] 內(nèi)胚層誘導(dǎo)階段：在步驟a分離得到的ADSCs中加入含有50~200nMIDEl和1~ 5yMCHIR99021 的RPMI-1640 培養(yǎng)基或者含有 50~200nMIDEl和 1 ~5yMCHIR99021 的DMEM/F12培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)時(shí)間為20~28小時(shí)。
[0010] 成肝誘導(dǎo)階段：在完成內(nèi)胚層誘導(dǎo)后的細(xì)胞中加入含有50-200nMIDE和 10-30ng/mLFGF4的 RPMI-1640培養(yǎng)基或者含有50-200nMIDE和10-30ng/mLFGF4的 DMEM/F12中培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)64~80小時(shí)。
[0011] 肝細(xì)胞的成熟階段：在完成成肝誘導(dǎo)后的細(xì)胞中加入肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF)至 100-200ng/mL、加入纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(FGF4)至10-30ng/mL、加入抑瘤素M(OsM)至20-40ng/mL、加入地塞米松（Dex)至1.5~3X10 5mol/L以及加入ITS預(yù)混通用培養(yǎng)添加 物的Williams' E培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為112~136小時(shí)。
[0012] 進(jìn)一步的，上述方法驟b所述內(nèi)胚層誘導(dǎo)階段為將步驟a分離得到的ADSCs在加 入IDEl至IOOnM和CHIR99021至3 yM的RPMI-1640培養(yǎng)基或者DMEM/F12培養(yǎng)基中誘導(dǎo) 培養(yǎng)，誘導(dǎo)時(shí)間為24小時(shí)。
[0013] 進(jìn)一步的，上述方法步驟b所述成肝誘導(dǎo)階段為將完成內(nèi)胚層誘導(dǎo)的ADSCs在加 入IDEl至IOOnM和加入FGF4至20ng/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基或者DMEM/F12中培養(yǎng)基誘 導(dǎo)培養(yǎng)72小時(shí)。
[0014] 進(jìn)一步的，步驟b所述成肝誘導(dǎo)階段為將完成肝誘導(dǎo)階段的ADSCs在加入肝細(xì)胞 生長(zhǎng)因子（HGF)至150ng/mL、加入纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子4至20ng/mL纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子 4(FGF4)、加入抑瘤素M(OsM)至30ng/mL、加入地塞米松（Dex)至1. 5~3X10 5mol/L以及 ITS預(yù)混通用培養(yǎng)添加物的Williams'E培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間120小時(shí)。
[0015] 其中，上述方法中分離得到的ADSCs在培養(yǎng)3-7代后再按步驟b所述方法進(jìn)行誘 導(dǎo)培養(yǎng)。
[0016] 其中，上述方法中所述ADSCs在進(jìn)行步驟b之前接種于I型膠原包被的培養(yǎng)皿中 進(jìn)行后繼誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0017] 其中，上述方法中所述ADSCs接種于I型膠原包被的培養(yǎng)皿中，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng) 皿底部后按步驟b的進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0018] 本發(fā)明方法適用于動(dòng)物的ADSCs誘導(dǎo)為iHeps。尤其是適用于嚙齒類(lèi)動(dòng)物的ADSCs 誘導(dǎo)為iHeps。優(yōu)選的，適用于大鼠的ADSCs。
[0019] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：使用本發(fā)明的分化方法，只需要八到十天左右的時(shí)間就足夠 產(chǎn)生具有肝細(xì)胞形態(tài)，基因表達(dá)及功能的肝細(xì)胞，是目前用時(shí)最短的肝細(xì)胞分化方法。本 發(fā)明方法能獲得ADSCs來(lái)源的肝細(xì)胞，使來(lái)自患者的自體脂肪組織的細(xì)胞治療肝病成為可 能，從而可以避免異體細(xì)胞的免疫排斥反應(yīng)。其次，誘導(dǎo)過(guò)程快速而高效，這將有利于臨床 治療方案的應(yīng)用。此外，根據(jù)誘導(dǎo)分化后的肝細(xì)胞的功能分析，使用這種分化方法獲得的細(xì) 胞作為肝細(xì)胞的資源，將有利于肝細(xì)胞移植的發(fā)展。因此，該方法為ADSCs在肝臟疾病細(xì)胞 治療中的應(yīng)用邁出了重要的一步。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞形態(tài)圖片。
[0021] 圖2為對(duì)誘導(dǎo)結(jié)束的細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)的結(jié)果。
[0022] 圖3為肝細(xì)胞特異性基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。
[0023] 圖4為使用誘導(dǎo)得到的iHeps進(jìn)行改善0：14誘導(dǎo)的急性肝損傷的功能試驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 本發(fā)明方法具體可按以下步驟進(jìn)行。
[0025] -、ADSC的分離、培養(yǎng)與擴(kuò)增。
[0026] ADSC的分離、培養(yǎng)與擴(kuò)增可按常規(guī)方法進(jìn)行。
[0027] 作為參考，本發(fā)明以大鼠為例，介紹以下具體方法：
[0028] 大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離：按0. 35-0. 4ml/100g體重，腹腔注射10%水合氯 醛麻醉大鼠，75%酒精浸泡lOmin。于超凈臺(tái)上無(wú)菌分離其腹股溝脂肪墊，在冷D-Hank's 液中漂洗3次，去除肉眼可見(jiàn)的纖維成分和血管，將其剪碎成Imm3左右的小顆粒，然后轉(zhuǎn)入 離心管并加入0. 1%I型膠原酶（每克脂肪組織加2-5mL)，置于37°C振蕩消化1小時(shí)。加 入等量的4°C預(yù)冷的含10%血清（FBS)的DMEM-LG培養(yǎng)基終止消化后，將離心管管上下顛 倒振蕩幾次進(jìn)一步加速組織塊離散，并用紗布過(guò)濾去除組織碎片。過(guò)濾液于4°C1500rpm離 心10分鐘，重復(fù)離心過(guò)程并棄去上清。將沉淀細(xì)胞用細(xì)胞裂解緩沖液重懸，室溫靜置IOmin 以裂解紅細(xì)胞。4°(：下1500印111離心10111111，棄上清后用含10%血清$83)的01^11-1^培養(yǎng) 基重懸細(xì)胞于75cm2培養(yǎng)皿中，并放置于5%CO2, 37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1天后，用Hank's平 衡鹽溶液漂洗培養(yǎng)皿2-3次，清除未貼壁細(xì)胞，加入含10 %血清（FBS)的DMEM-LG培養(yǎng)基繼 續(xù)培養(yǎng)。每2天換培養(yǎng)液1次，直至細(xì)胞達(dá)到覆蓋80-90%培養(yǎng)皿底后用0. 25%胰酶溶液 消化進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代3-7代后用于誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0029] 二、將ADSCs誘導(dǎo)成成熟的肝細(xì)胞
[0030] 將3-7代的ADSCs接種于I型膠原包被的培養(yǎng)皿中。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿底部后進(jìn) 行為期約9天的成肝誘導(dǎo)（表1)。
[0031] 表I.ADSC向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)條件
[0032] 在加入CHIR99021至1~5yM的RPMI-1640培養(yǎng)基或者DMEM/F12培養(yǎng)基中誘 導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)時(shí)間為20~28小時(shí)；
[0033] 成肝誘導(dǎo)階段：將完成內(nèi)胚層誘導(dǎo)后的細(xì)胞中加入IDEl至50~200nM和FGF4至 10~30ng/mL的RPMI-1640培養(yǎng)基或者DMEM/F12中培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)64~80小時(shí)；
[0034] 肝細(xì)胞的成熟階段：將完成肝誘導(dǎo)階段后的細(xì)胞中加入肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子至100~ 200ng/mL、加入纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子4至10~30ng/mL、加入抑瘤素M至20~40ng/mL、加 入地塞米松至2X10 5m〇l/L以及加入ITS預(yù)混通用培養(yǎng)添加物的Williams'E培養(yǎng)基中誘 導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間112~136小時(shí)。
[0035] 表I.ADSC向肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)條件

[0038] 本文中使用的部分添加物為：
[0039]IDEl(購(gòu)自tocris公司，CasNo. :1160927-48-9)，分子量：306. 31 ;分子 式：C15H18N205?；瘜W(xué)名：l-[2-[(2-Carboxyphenyl)methylene]hydrazide]heptanoic acid〇
[0040] 結(jié)構(gòu)式：
[0041]
[0042]CHIR99021(購(gòu)自selleck公司，ct99021)分子量：465. 34。
[0043]化學(xué)名：6 ((2 ((4_ (2, 4_ 二氯苯基）一 5 -（4-methyl-lh-imidazol_2-yl)啼 啶_2_基）氨基）乙基）氨基）煙腈。
[0044]化學(xué)式：C22H18CL2N8;CAS號(hào)：252917-06-09 ;
[0045] 結(jié)構(gòu)式：
[0046]
[0047] 本實(shí)施例使用的所述ITS預(yù)混通用培養(yǎng)添加物為康寧公司產(chǎn)品（ITS PremixUniversalCultureSu