豬圓環(huán)病毒2型毒株及由其制備的滅活疫苗和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及豬圓環(huán)病毒株，尤其涉及一株豬圓環(huán)病毒2型毒株，本發(fā)明還涉及由 所述豬圓環(huán)病毒2型毒株制備的滅活疫苗及其應(yīng)用，屬于豬圓環(huán)病毒2型毒株的分離和應(yīng) 用領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬圓環(huán)病毒2型（PCV2)感染是造成斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（(PMffS)的主要 原因，該病以免疫抑制和斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭為特征，病豬主要表現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育不良、貧血、 呼吸困難、腹瀉、衰弱、增重遲緩、淋巴結(jié)腫大等臨床癥狀。同時(shí)由于是免疫抑制性疾病，機(jī) 體免疫防御功能降低，致使臨床上常常發(fā)生混合感染，產(chǎn)生所謂的各種綜合征，如：豬皮炎 腎病綜合征，仔豬先天性震顫以及母豬繁殖障礙等，增加了疾病控制的難度。自1991年在 加拿大豬群中爆發(fā)以來(lái)，該病毒在全球迅速傳播，目前PCV2已呈全球分布，豬群感染率越 來(lái)越高。中國(guó)于2000年首次報(bào)道PCV2以來(lái)，該病毒在中國(guó)豬場(chǎng)中感染率迅速上升，豬群的 平均陽(yáng)性率大于20%，有的甚至超過50%，有些地區(qū)高達(dá)100%，給中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大 的經(jīng)濟(jì)損失，急需采取防治措施控制該病毒的傳播。
[0003] 至目前為止，國(guó)內(nèi)外的試驗(yàn)表明，疫苗是預(yù)防此病的主要措施之一，為了有效地預(yù) 防PCV2感染，國(guó)內(nèi)外相繼開展了許多有關(guān)PCV2滅活疫苗和基因工程疫苗的研究，并取得了 一定效果。迄今為止，尚缺乏一種安全、高效、廉價(jià)的PCV2滅活疫苗。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一株分離的豬圓環(huán)病毒2型毒株，采用該毒株 制備的滅活疫苗免疫原性好，能夠有效防治由豬圓環(huán)病毒2型引起的各種疾病。
[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明首先公開了一株分離的豬圓環(huán)病毒2型Yh-I株。
[0007] 本發(fā)明將分離的豬圓環(huán)病毒2型Yh-I株提交專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生 物保藏編號(hào)為：CGMCCNo. 10409 ;分類名是：豬圓環(huán)病毒（Porcinecircovirus);保藏時(shí)間 是：2015年3月2日；保藏單位是：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏 地址是：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0008] 本發(fā)明將內(nèi)蒙古某發(fā)病豬場(chǎng)發(fā)病死亡仔豬，分別取肺臟和淋巴結(jié)，置于-70°C超低 溫冰箱中保存?zhèn)溆?。剪取一定體積病料，加入5倍體積的5%血清的MEM，使用玻璃研磨器 研磨，勻漿經(jīng)12000rpm4°C離心lOmin，上清使用0. 22ym濾器過濾除菌待用；將RT-PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性的病料上清過濾除菌后，接種于已長(zhǎng)至90%的單層PK-15細(xì)胞上，每個(gè)T-25細(xì) 胞瓶lmL，放入37°C的5%CO2培養(yǎng)箱中孵育lh，棄上清并加入含2%胎牛血清的MEM9mL 繼續(xù)37°C培養(yǎng)，連續(xù)傳至第3代。采用微載體懸浮培養(yǎng)圓環(huán)病毒，得到豬圓環(huán)病毒液，連續(xù) 傳15代。通過連續(xù)傳代獲得了穩(wěn)定的高滴度的PCV-2病毒，病毒傳至第4代，TCID5。值為 I.OX106'?，傳至第11代時(shí)，TCID5。值達(dá)到LOX10 〃°，最終病毒的滴度穩(wěn)定在LOX10〃° 左右。
[0009] 本發(fā)明豬圓環(huán)病毒2型Yh-I株能夠應(yīng)用于制備預(yù)防由豬圓環(huán)病毒所引起的各種 疾病的疫苗或藥物。
[0010] 本發(fā)明進(jìn)一步公開了一種預(yù)防由豬圓環(huán)病毒所引起的各種疾病的疫苗組合物，包 括：免疫上有效量的豬圓環(huán)病毒2型Yh-I株和藥學(xué)上可接受的佐劑。
[0011] 本發(fā)明還公開了一種預(yù)防由豬圓環(huán)病毒所引起的各種疾病滅活疫苗的制備方法， 包括以下步驟：（1)擴(kuò)增所述的豬圓環(huán)病毒2型Yh-I株，收獲病毒液；（2)加入滅活劑滅活 病毒液，濃縮；（3)制備水相和油相；(4)將水相和油相混合，乳化，即得。
[0012] 其中，步驟（1)所述擴(kuò)增為采用PK-15細(xì)胞培養(yǎng)豬圓環(huán)病毒2型Yh-I株；優(yōu)選的， 將分離的豬圓環(huán)病毒2型Yh-I株按病毒維持液量的1 %接入形成PK-15細(xì)胞培養(yǎng)物中；所 述培養(yǎng)條件優(yōu)選為37 °C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。
[0013]步驟⑵按照質(zhì)量g/體積mL計(jì)，滅活劑與病毒液的比例為0.02 :100 ;所述滅活 劑為甲醛。
[0014] 步驟⑶所述制備水相包括：將吐溫-80與濃縮后的滅活病毒液按照體積比4 :96 混合均勻，得到水相；
[0015] 所述制備油相包括：將油佐劑、司本-80、硬脂酸鋁按照體積比94 :6 :2混合均勻。
[0016] 步驟⑷將水相和油相按照體積比I:1. 5的比例混合均勻。
[0017]安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明制備的滅活疫苗對(duì)豬安全性好，免疫前后豬沒有體 溫升高的現(xiàn)象。豬群采食和精神正常。單倍劑量和雙倍劑量疫苗注射后，連續(xù)觀察14d，均 未見注射部位有腫塊出現(xiàn)，免疫后28d，每組解剖2頭豬，注射部位也未見有白色油乳劑樣 物質(zhì)存在，疫苗吸收很完全。說明本發(fā)明的滅活疫苗接種后對(duì)豬是安全的。
[0018] 免疫原性試驗(yàn)結(jié)果表明，在仔豬免疫攻毒試驗(yàn)中，用本發(fā)明的滅活疫苗免疫后21 天，仔豬抗體全部轉(zhuǎn)陽(yáng)，攻毒后，免疫組保護(hù)率可達(dá)100%，所有試驗(yàn)動(dòng)物均未發(fā)病。本發(fā)明 分離的豬圓環(huán)病毒2型Yh-I株制備的滅活疫苗保護(hù)率為100%，證明本發(fā)明分離的豬圓環(huán) 病毒2型Yh-I株免疫原性好，免疫保護(hù)力強(qiáng)。
[0019] 本發(fā)明所涉及到的術(shù)語(yǔ)宙義
[0020] 除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的 普通技術(shù)人員通常所了解相同的含義。
[0021] 術(shù)語(yǔ)"分離的"意指所指代的材料從其天然環(huán)境中取出。因此，經(jīng)分離的生物材料 可以不含某些或所有細(xì)胞組分，即其中天然材料自然存在的細(xì)胞的組分（例如細(xì)胞質(zhì)或膜 組分）。如果材料存在于細(xì)胞提取物或上清液中，那么它是經(jīng)分離的。
[0022] 可互換使用的術(shù)語(yǔ)"疫苗"或"疫苗組合物"指這樣的藥物組合物，其包括在動(dòng)物 中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的至少一種免疫原性組合物。疫苗或疫苗組合物可以保護(hù)動(dòng)物免受由于感 染的疾病或可能的死亡，并且可以包括或不包括增強(qiáng)活性組分的免疫活性的一種或多種另 外組分。疫苗或疫苗組合物可以另外包括對(duì)于疫苗或疫苗組合物典型的進(jìn)一步組分，包括 例如佐劑或免疫調(diào)節(jié)劑。疫苗的免疫活性組分可以包括以其原始形式的完全活生物體或在 經(jīng)修飾的活疫苗中作為經(jīng)減毒的生物體，或在經(jīng)殺死或滅活的疫苗中通過合適方法滅活的 生物體，或包括病毒的一種或多種免疫原性組分的亞單位疫苗，或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已 知的方法制備的遺傳改造、突變或克隆的疫苗。疫苗或疫苗組合物可以包括一種或同時(shí)超 過一種上述組分。
[0023] 術(shù)語(yǔ)"佐劑"意指包括一種或多種物質(zhì)的組合物，所述物質(zhì)增強(qiáng)疫苗組合物的抗原 性。佐劑可以充當(dāng)緩慢釋放抗原的組織儲(chǔ)存，并且還充當(dāng)非特異性增強(qiáng)免疫應(yīng)答的淋巴樣 系統(tǒng)激活。通常，在不存在佐劑的情況下，用單獨(dú)抗原的初次疫苗接種將無(wú)法引發(fā)體液或細(xì) 胞免疫應(yīng)答。佐劑包括但不限于完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、礦物質(zhì)凝膠例如氫氧化 鋁、表面活性物質(zhì)。
[0024] 術(shù)語(yǔ)"免疫有效量"是將引發(fā)針對(duì)豬圓環(huán)病毒的免疫應(yīng)答的無(wú)毒力豬圓環(huán)病毒毒 株的量。"免疫有效量"將依賴于受體動(dòng)物的物種、品種、年齡、大小、健康狀況等因素。
【附圖說明】
[0025] 圖IPCV2的PCR擴(kuò)增結(jié)果；1.陰性對(duì)照；2.DL2000marker;3.PCR擴(kuò)增片段。
[0026] 圖2PK-15細(xì)胞分離毒的間接免疫熒光鑒定結(jié)果；A:感染分離毒的PK-15細(xì)胞； B:未感染分離毒的PK-15細(xì)胞。
[0027] 圖3豬圓環(huán)病毒強(qiáng)毒攻毒后各組動(dòng)物的體溫測(cè)定結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入