H9n2亞型禽流感病毒溫度敏感性減毒活疫苗候選株ca-28（ah）及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種通過對H9N2亞型禽流感病毒（Avianinfluenzavirus,AIV)在 SPF雞胚中逐步梯度降溫培養(yǎng)構(gòu)建廣譜性H9N2亞型AIV溫度敏感性減毒活疫苗的方法，主 要涉及的AIV為BJ-94-like和Y280-like譜系的毒株。
【背景技術(shù)】
[0002] H9N2亞型禽流感病毒自1994年從我國廣東省某雞群中分離以來，很快蔓延至其 它地區(qū)，并逐漸呈地方性流行，給我國養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。除了感染家禽外， H9N2亞型禽流感病毒還能感染哺乳動(dòng)物（豬和人等）。雖然H9N2亞型AIV感染人只是引 起輕微的臨床癥狀，但H9N2亞型的AIV能夠與其它亞型AIV發(fā)生重組產(chǎn)生新型流感病毒。 因此，H9N2AIV對養(yǎng)殖業(yè)和人類健康均有危害，是非常重要的人獸共患病病原體。
[0003] 疫苗免疫是防控禽流感的有效手段。然而由于AIV的基因組是分節(jié)段的RNA， RNA聚合酶的復(fù)制具有一定的突變率，因此流感病毒能夠快速發(fā)生遺傳變異，導(dǎo)致現(xiàn)有 滅活疫苗防控禽流感效果不理想。目前我國使用的全病毒滅活疫苗既有針對早期的毒 株，如Ck/SH/F/98 和Ck/SD/6/96(BJ-94-like譜系）（Li,C.，Yu,K.，Tian,G.，Yu,D.，Li u,L. ,Jing,B. ,Ping,J. ,Chen,H. , 2005.EvolutionofH9N2influenzavirusesfrom domesticpoultryinMainlandChina.Virology340,70-83)。也有針對近期的流行 株（Y280-like譜系）（Zhang,Y.，Yin,Y.，Bi,Y.，Wang,S.，Xu,S.，Wang,J.，Zhou,S.，Su n,T. ,Yoon,K.J. 2012.MolecularandantigeniccharacterizationofH9N2avian influenzavirusisolatesfromchickenflocksbetween1998and2007inChina. VetMicrobiol156,285-293.)，免疫雞群仍不時(shí)有H9N2亞型Al的疫情爆發(fā)。實(shí)驗(yàn)室條件 下，SPF雞群接種早期毒株制備的滅活疫苗后，使用當(dāng)前流行的H9N2亞型AIV以滴鼻方式 進(jìn)行攻毒，仍會(huì)發(fā)生高水平的排毒（Sun,Y.，Pu,J.，Jiang,Z.，etal.Genotypicevolution andantigenicdriftofH9N2influenzavirusesinChinafrom1994to2008.Vet Microbiol，2010, 146:215-225.);而使用部分流行株制備的滅活疫苗也不能很好地保護(hù) SPF雞只抵御H9N2病毒的攻擊（劉東，宮曉，劉曉東，等.2013.H9N2亞型禽流感流行分析及 疫苗毒株的篩選.中國動(dòng)物檢疫.2013年第30卷第6期：45-50 ;萬曉朋，曾顯營，田國彬， 等.2010.H9N2亞型禽流感流行株滅活疫苗種毒的篩選.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào).第32卷第4 期：277-280)。因此，研制針對不同譜系H9亞型AIV毒株具有交叉保護(hù)性的疫苗迫在眉睫。
[0004] 與傳統(tǒng)的滅活疫苗相比，減毒活疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生黏膜免疫和細(xì)胞免疫，具 有交叉保護(hù)效果好優(yōu)勢。而且，減毒活疫苗可通過噴霧或者飲水的方式免疫，使用更方便， 大大降低了人力成本。以新城疫疫苗為例，不需注射而僅用飲水就能快速、方便地完成雞 只的大規(guī)模免疫（SenneDA,KingDJ,KapczynskiDR.ControlofNewcastledisease byvaccination.Developmentsinbiologicals,2004, 119 165-70.)。來自具有溫度 敏感特性病毒（A/GuineaFowl/HonKong/WF10/99)的內(nèi)部基因配合H5N1亞型病毒（A/ Vitnam/1203/04)的HA及NA基因的重組病毒疫苗能夠賦予雞對H5N1亞型高致病性流感 病毒較好的抵抗力（Song,H.，Nieto,G.R.,Perez,D.R.Anewgenerationofmodified live-attenuatedavianinfluenzavirusesusingatwo-strategycombinationas potentialvaccinecandidates[J].Journalofvirology,Sep, 2007, 81 (17):9238-48.)〇 因而減毒活疫苗在對禽流感防控上具有極大的應(yīng)用潛力。
[0005]本研究中，我們選取A/chicken/Anhui/1/2008 (AH)株（YinbiaoZhu，YangYang， WeiLiu,XinLiu,DaYang,ZhihaoSun，YongJu，SujuanChen，DaxinPeng,Xiufan Liu.ComparisonofbiologicalcharacteristicsofH9N2avianinfluenzaviruses isolatedfromdifferenthostsArchivesofvirology2015Jan24. ; 1432-8798)，米 用逐步梯度降溫的方法將其置于SPF雞胚中連續(xù)傳代適應(yīng)培養(yǎng)，獲得一系列不同溫度下的 適應(yīng)毒株。使用SPF雞胚測定不同溫度適應(yīng)毒的冷適應(yīng)特性（Cold-adapted，Ca)和溫度敏 感特性（Temperature-sensitive，Ts)。免疫雞測定病毒毒力下降情況。免疫雞后測定血清 的抗體應(yīng)答水平，觀察其對不同譜系H9亞型AIV攻毒提供的保護(hù)作用。挑選出毒力致弱、 免疫效力出色且具有理想保護(hù)效力的適應(yīng)毒作為減毒活疫苗候選株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]H9N2亞型AIV感染給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前主要使用H9N2亞型禽流 感滅活疫苗來防控該病。由于J19N2亞型禽流感滅活疫苗只能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的HI抗體，不 能提供細(xì)胞免疫和黏膜免疫，對易發(fā)生抗原變異的J19N2亞型AIV很難提供交叉保護(hù)，常常 發(fā)生免疫失敗。為了解決上述問題有必要研制出能提供細(xì)胞免疫、體液免疫和黏膜免疫，產(chǎn) 生交叉保護(hù)性的新型弱毒活疫苗。
[0007] 本發(fā)明選取當(dāng)前流行的Y280譜系的A/chicken/Anhui/l/2008(AH)株，采用逐步 梯度降溫的方法將其置于SPF雞胚中連續(xù)傳代適應(yīng)培養(yǎng)，獲得一系列不同溫度下的適應(yīng) 毒。使用SPF雞胚測定不同溫度適應(yīng)毒的冷適應(yīng)特性（Cold-adapted，Ca)和溫度敏感特性 (Temperature-sensitive，Ts)。測定低溫適應(yīng)毒的毒力指標(biāo)和免疫抗體產(chǎn)生情況，篩選出 安全性好且免疫原性好的低溫適應(yīng)毒作為疫苗候選株，免疫雞后評價(jià)其對不同譜系H9亞 型AIV攻毒提供的保護(hù)作用，篩選出能提供交叉保護(hù)的弱毒活疫苗。
[0008] 本發(fā)明提供了一株H9N2亞型禽流感病毒CA-28 (AH)，其保藏號(hào)是CGMCC No.11037。
[0009] 本發(fā)明還公開了所述的H9N2亞型禽流感病毒CA-28 (AH)在制備溫度敏感性減毒 活疫苗中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明所述疫苗候選株CA-28 (AH)僅能在氣管中低程度復(fù)制，不發(fā)生接觸傳播， 安全性好。免疫雞后可產(chǎn)生較高的HI抗體，能對我國流行的兩個(gè)譜系BJ/94和Y280中的 禽流感病毒提供很好的交叉保護(hù)。該疫苗候選株既可單獨(dú)使用，成為亞型禽流感防控的 有效工具，亦可與滅活疫苗聯(lián)合使用，提供更為確實(shí)的免疫保護(hù)作用。將在H9亞型禽流感 防控中發(fā)揮極為重要的作用。
[0011] 本發(fā)明菌株CA-28(AH)于2015年8月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員 會(huì)普通微生物中心（地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所）， 分類命名為禽流感病毒，保藏編號(hào)為CGMCCNo. 11037。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 本發(fā)明的毒株CA-28(AH)要下文中簡稱為CA-28。
[0013] 本發(fā)明中具體的試驗(yàn)方案：
[0014] 1.低溫培養(yǎng)致弱病毒
[0015]用PBS將A/Chicken/Anhui/1/2008(AH)株病毒（ZhuY，YangY，LiuW，et al.ComparisonofbiologicalcharacteristicsofH9N2avianinfluenzaviruses isolatedfromdifferenthosts,Archivesofvirology, 2015, 160:917-927)稀釋成4HA 單位/100yL，經(jīng)尿囊腔接種4枚10日齡SPF雞胚，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后，將接種雞 胚置于4°C冰箱過夜后，收取其尿囊液并進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)。將雞胚培育溫度從37°C逐步降低 到25°C，每次降低1°C。從37°C到26°C，病毒在每溫度點(diǎn)用雞胚傳代10次，而在25°C則傳 代25次。之后對每個(gè)代次末次傳代的病毒采取有限稀釋法用雞胚對其純化，收集純化后的 病毒，分裝后存放于_70°C冰箱。
[0016] 2.低溫培育毒株株冷適應(yīng)及溫度敏感性特性鑒定
[0017] 2. 1 冷適應(yīng)特性（Cold-adapted)鑒定
[0018] 冷適應(yīng)性（Ca)是將病毒株在合適的生長溫度33°C條件下和在低溫26°C生長條件 下在10日齡雞胚中的復(fù)制滴度進(jìn)行比較。在26°C低溫條件下，如果病毒在雞胚中的生長滴 度比其在33°C下的滴度的差值在100倍以內(nèi)時(shí)，那么就認(rèn)為這個(gè)病毒具有冷適應(yīng)特征，反 之亦然。
[0019] 為了鑒定低溫培育毒株是否具有冷適應(yīng)特性，將4個(gè)HA單位/100yL的低溫培 育毒株及其親本病毒W(wǎng)T-AH接種雞胚后，分別置于26°C和33°C中培養(yǎng)。病毒培養(yǎng)72小 時(shí)后，收集尿囊液，并在33°C條件下測定病毒的半數(shù)感染量（EIDm)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在 33°C下，低溫培育毒株（CA-25、CA-26、CA-27和CA-28)及其親本病毒W(wǎng)T-AH均能較好的 生長：低溫培育毒株的平均EID5。值為7. 5-8.Olog1QEID5Q/0.Iml;WT-AH的平均EID5。值為 8. 01og1QEID5Q/0.lml。而在 26°C條件下，CA-25、CA-26 和CA-27 的繁殖滴度比 33°C下略低， 為 7. 0-7. 21og1QEID5Q/0.lml，而CA-28 和WT-AH則完全無法復(fù)制（表 1)。因此除了CA-28 和WT-AH外，其它低溫培育毒株均具有冷適應(yīng)特性。
[0020] 2. 2 溫度敏感特性（Temperature-sensitive)鑒定
[0021] 溫度敏感