明利用大腸桿菌表達系統(tǒng)構建了 纖維素酶的工程菌，可以用來快速、大量表達纖維素酶。所需培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件簡單，工藝 簡單，周期短，可以大大降低生產成本。在構建載體時在纖維素酶的C-末端加入了組氨酸 (His)標簽，可與鎳柱特異性結合，便于純化，具有廣闊的工業(yè)應用前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發(fā)明構建的大腸桿菌BL21 (DE3)表達載體CelA-pET-30a結構示意圖； 圖2為本發(fā)明中重組質粒的單雙酶切圖譜，圖中：M是marker;泳道1是重組質粒，泳道 2是雙酶切結果，泳道3是克隆產物； 圖3是本發(fā)明SDS-PAGE檢測純化效果示意圖，圖中M是marker，泳道1是未加誘導劑 對照；2是未純化的誘導表達蛋白；3是純化后的蛋白。
【具體實施方式】
[0017] 本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限定本發(fā) 明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件 或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過購買獲得的 常規(guī)產品。
[0018] 實施例1 :從芽孢桿菌（sp)中分離得到的纖維素酶基因CdJ的核苷酸 序列。采用CTAB法提取芽孢桿菌的基因組DNA，取2y1為模板進行聚合酶鏈式反應（PCR)， 根據已發(fā)表的纖維素酶同源序列的保守區(qū)，結合所用載體設計引物（引物F和引物R)，在此 PCR反應過程中所用引物、組分和擴增條件如下：
擴增條件：94°C預變性4min，94°C變性45s，55°C退火45s，72°C延伸90s，72°C補齊末端lOmin，變性、退火、延伸三步進行30個循環(huán)。PCR擴增結束后用瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果 顯示，得到了大小約IlOObp的片段，用多功能DNA純化回收試劑盒(離心柱型）（北京百泰 克生物技術有限公司）回收，把回收片段亞克隆到PMD-18T(TaKaRa公司產品）中，連接產 物轉化到用CaCV法處理的大腸桿菌DH5a，在含氨芐青霉素（1〇〇yg/ml)的LB固體平板 上進行培養(yǎng)，挑取平板上生長的白色菌落，通過菌落PCR驗證陽性克隆，將驗證為陽性的克 隆子接入到LB液體培養(yǎng)基(加入100yg/ml氨芐青霉素)，37°C過夜培養(yǎng)，用高純質粒小量 提取試劑盒(離心柱型）（北京百泰克生物技術有限公司）提取質粒，經測序(北京奧科鼎盛 生物科技有限公司），測序結果顯示所得片段大小為l〇41bp。
[0019] 實施例2 :重組表達載體的構建 實施例1中擴增得到的片段，因其引物F的5'端含有及I酶切位點（第3個堿基 到第8個堿基)，引物R的5'端含有此oRI酶切位點（第2個堿基到第7個堿基)，所以使 用這兩個酶對片段進行雙酶切，同時將PET30a用相同的酶進行雙酶切，電泳回收酶切大片 段，并用T4連接酶在16°C連接10h，構建成功的載體示意圖如圖1所示。連接產物用化學 轉化法轉化入大腸桿菌BL21 (DE3)中，在含卡那霉素（100yg/ml)的LB固體平板上進行培 養(yǎng)，挑取平板上生長的白色菌落，通過菌落PCR和提取質粒單、雙酶切（圖2)篩選到陽性克 隆并測序鑒定，成功構建含有纖維素酶基因的大腸桿菌宿主細胞。
[0020] 實施例3 :纖維素酶的制備 將實施例2中得到的重組工程菌按1%接種量接到100mlLB液體培養(yǎng)基(含1%。50mg/ml卡那霉素)，37°C，150rpm培養(yǎng)到OD6m=O. 6,加入 1%。的lmmol/1IPTG(異丙基-P-D-硫 代P比喃半乳糖苷)，轉到16°C，80rpm誘導IOh后，離心收集菌體，將菌體用5ml50mmol/l 的咪唑緩沖液（pH8. 2)懸浮，超聲破碎。離心取上清，然后用5ml50mmol/l的咪唑緩沖液 (pH8. 2)懸浮，分別取50y1進行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)，條帶出現(xiàn)在離心后 的沉淀中，說明得到的重組蛋白是包涵體。
[0021] 實施例4 :包涵體的變性復性以及酶活的測定 將工程菌按實施例3的方法誘導表達，收集菌體，超聲破碎，離心后去掉上清，用5ml8mol/l的尿素溶液（pH8.0)重懸沉淀，于37°C過夜使包涵體變性。將變性后的溶液裝入到 透析袋中，放入透析液（TisBasel2. 14g/l，用HCl調pH至8,然后每升加入200 巰 基乙醇）中透析24h復性，其中換液兩次。
[0022] 酶活力單位的定義：1毫升液體酶(或1克固體酶粉)，在40°CpH= 4. 6條件下，每 分鐘水解羧甲基纖維素鈉（CMC-Na)，產生I.Oug的葡萄糖，即為1個酶活單位，以u/g(u/ ml)表不。
[0023] 酶活的測定采用CMC糖化力法，CMC-Na在纖維素酶的作用下，水解產生纖維寡糖、 纖維二糖、葡萄糖等還原糖，還原糖能將3,5_二硝基水楊酸中的硝基還原成橙黃色的氨基 化合物，在540nm波長下測定吸光度值A，吸光度與酶活成正比。CMC-Na糖化力主要代表內 切P-1. 4-葡聚糖的活力；我們測得復性后的包涵體的粗酶活為82U/mL。
[0024] 實施例5 :纖維素酶的純化 將實施例4中變性又復性后的蛋白液上鎳柱進行純化，鎳柱中的硫酸鎳可以與有His(組氨酸）標簽的蛋白結合，也可以與咪唑結合。先將蛋白液以一定速度通過鎳柱使蛋白質 掛柱，然后用不同濃度的咪唑緩沖液進行洗脫，洗脫液用SDS-PAGE電泳檢測，純化的效果 如圖3所示。
[0025] 以上描述了本發(fā)明的基本內容、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術人員應 該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的 原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改 進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權利要求書及其等效物 界定。
【主權項】
1. 一種纖維素酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。2. 編碼權利要求1所述的纖維素酶的基因。3. 根據權利要求2所述的纖維素酶的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 所示。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種纖維素酶，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO:2所示，其編碼基因序列如SEQ？ID？NO:1所示，通過構建重組載體并在大腸桿菌中表達，表達產物具有1,4-β-D內切葡聚糖功能，本發(fā)明的纖維素酶可用于各種含纖維素纖維的處理。
【IPC分類】C12N9/24, C12N15/56
【公開號】CN105087518
【申請?zhí)枴緾N201510519302
【發(fā)明人】魏云林, 崔尹贍, 季秀玲, 浦紹占, 林連兵, 張琦
【申請人】昆明理工大學
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月24日