一種定點(diǎn)突變的大腸桿菌dna光修復(fù)酶及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種大腸桿菌光修復(fù)酶及其構(gòu)建方法，特別屬于大腸桿菌DNA光修復(fù) 酶及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 由于人類活動(dòng)造成的污染與破壞，使得大氣中的臭氧層愈發(fā)稀薄，陽光里的紫外 光強(qiáng)度增加，對人類的傷害越來越大，特別是損傷細(xì)胞內(nèi)部的DNA。紫外光破壞DNA的結(jié)構(gòu)， 會(huì)阻止DNA的正常復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，會(huì)引起皮膚及組織細(xì)胞內(nèi)的信號通路發(fā)生改變，造成免疫 的抑制，皮膚的炎癥，在細(xì)胞內(nèi)積累大量的CPD甚至造成皮膚癌（李沛波，關(guān)永源，賀華，丘 欽英etal.中波段紫外線對角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和鈣信號的影響[J].中國藥理學(xué)通 報(bào)，2004, 20(4) :398-402.)。這主要是由于紫外光造成DNA同一條鏈上的相鄰的胸腺嘧啶 堿基產(chǎn)生環(huán)丁燒啼啶二聚體（cyclobutanepyrimidinedimer，CPD)，該光化學(xué)產(chǎn)物使DNA 結(jié)構(gòu)異常。
[0003] 大腸桿菌DNA光修復(fù)酶在可見光作用下，能夠裂解還原環(huán)丁烷嘧啶二聚體，恢復(fù) DNA的正常結(jié)構(gòu)。它是一種典型的環(huán)丁烷嘧啶二聚體光修復(fù)酶，通過特異性地結(jié)合在DNA 的嘧啶二聚體上，專一吸收波長300-500nm的近紫外可見光，從而產(chǎn)生活性，將環(huán)丁烷嘧啶 二聚體還原為兩個(gè)胸腺嘧啶，這是生物體利用光為驅(qū)動(dòng)力來修復(fù)紫外線DNA損傷的重要途 徑?，F(xiàn)有的DNA光修復(fù)酶主要用于動(dòng)物模型和人體實(shí)驗(yàn)研究中，顯示其在修復(fù)基因損傷及 阻止基因損傷誘導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)中具有重要作用，但現(xiàn)有的DNA光修復(fù)酶的穩(wěn)定性比較 差，抗氧化能力比較低。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0004] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問第1個(gè)技術(shù)問題是提供穩(wěn)定性好的一種定點(diǎn)突變的大腸 桿菌DNA光修復(fù)酶。
[0005] 本發(fā)明所要解決的第2個(gè)技術(shù)問題是上述光修復(fù)酶的構(gòu)建方法。
[0006] 本發(fā)明所要解決的第3個(gè)技術(shù)問題是提供上述變體基因編碼的光修復(fù)酶或包含 上述變體基因的表達(dá)單元、重組質(zhì)粒、或宿主細(xì)胞。
[0007] 定點(diǎn)突變（site-specificmutagenesis或site-directedmutagenesis)是指通 過在目的DNA片段（質(zhì)粒，基因組）中某些目標(biāo)位點(diǎn)引入特定的變化（包括堿基的添加，刪 除，點(diǎn)突變等）。體外定點(diǎn)突變技術(shù)是研究蛋白功能與基因之間關(guān)系的主要手段，也是實(shí)驗(yàn) 室里優(yōu)化基因的常用手段，為改造及優(yōu)化蛋白質(zhì)提供了有力的條件。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)等方法將某個(gè)目的基因的特定堿基突變（堿基缺失或者插入等），從而改變翻譯出來 的氨基酸序列，以及隨之折疊成的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)和發(fā)揮的功能，有利于分析蛋白質(zhì)結(jié) 構(gòu)和功能的關(guān)系。
[0008] 本發(fā)明從現(xiàn)有的WT大腸桿菌（Escherichiacoli)中獲得DNA光修復(fù)酶基因 (phr)，設(shè)計(jì)突變引物得到突變的基因片段，其編碼如SEQIDN0:1所示的氨基酸序列，連接 突變基因片段與pET22b質(zhì)粒，構(gòu)建出重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-A377N;將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大 腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建出用于突變體酶表達(dá)的基因工程菌BL21 (DE3)/pET22b-A377N;在 18°C和ImMITPG條件下獲得了較好的表達(dá)。表達(dá)出的光修復(fù)酶活性更加穩(wěn)定，而且酶的抗 氧化效果顯著提高。
【附圖說明】：
[0009] 圖1為phr基因的PCR擴(kuò)增圖
[0010] M:DL2000 ;1:phr基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物
[0011] 圖2為A377N片段PCR擴(kuò)增圖
[0012] M:DL2000 ;2:A377N上游片段；3 :A377N下游片段；
[0013] 圖3為A377N融合PCR擴(kuò)增圖
[0014]M:DL2000;4 :A377N融合PCR產(chǎn)物。
[0015] 圖4為實(shí)施例1所制的光修復(fù)酶純化的SDS-PAGE電泳圖
[0016]C為菌體總蛋白，P為菌體沉淀，S為破碎上清，E1-E3為純化蛋白分管收集樣品， PM為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。
[0017] 圖5為實(shí)施例1所制的光修復(fù)酶（A377N)及WT光修復(fù)酶的活性曲線
[0018] A377N:檢測的是第1、3、6、8、12、42天的酶活性變化
[0019]WT:檢測的是第1、3、5、6、11、41天的酶活性變化
[0020] 圖6為實(shí)施例1所制的光修復(fù)酶（A377N)及WT光修復(fù)酶的450nm吸收峰變化曲 線。
[0021] △377^檢測的是第1、2、3、4、5、12、42天的450_吸收峰的變化
[0022] WT:檢測的是1、2、3、4、5、6、11、41天的450nm吸收峰的變化
[0023] 圖7為實(shí)施例1所制的光修復(fù)酶（A377N)及WT光修復(fù)酶的580nm吸收峰變化曲 線
[0024] △377^檢測的是第1、2、3、4、5、6、8、12、42天的580_吸收峰的變化
[0025]WT:檢測的是1、2、3、4、5、6、11、41天的580nm吸收峰的變化
【具體實(shí)施方式】：
[0026] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)的說明。
[0027] 實(shí)施例1 :
[0028]1、獲得WT大腸桿菌光修復(fù)酶基因phr
[0029]通過已知的大腸桿菌（Escherichiacoli)光修復(fù)酶（cyclobutanepyrimidine dimerphotolyase,CPDase，EC4.I. 99. 3) (WT)基因設(shè)計(jì)引物，以E.coli基因組DNA為模板， 經(jīng)PCR擴(kuò)增出目的片段（如圖1)。phr擴(kuò)增引物及PCR條件分別為：
[0030]phrF(Ndel) :5' -CTCCATATGACTACCCATCTGGTCTG-3'
[0031]phrR(XhoI)-.5'-GTGCTCGAGTTTCCCCTTCCGCGCC-3r
[0032] 95°C預(yù)變性 5min;94°C30s，60°C30s，72°C2min循環(huán) 30 次；72°C充分延伸 10min。
[0033] 2、構(gòu)建重組載體pET22b-phr
[0034] 將擴(kuò)增出的基因片段與質(zhì)粒pET22b，通過Ndel、XhoI雙酶切，在16°C連接20h， 轉(zhuǎn)化到E.coliDH5a。篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，獲得重組質(zhì)粒pET22b-phr。將雙酶切鑒定后， 送南京金斯瑞生物公司進(jìn)行測序，序列比對發(fā)現(xiàn)測序基因與Genbank(GeneBankaccession NO.NC_000913. 3)上的完全一致。
[0035] 3、構(gòu)建突變體菌株
[0036] 設(shè)計(jì)突變引物，以重組質(zhì)粒pET22b-phr的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出上下 游片段（如圖2)，將上下游片段融合成目的片段（如圖3)。將該片段與pET22b載體連接， 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET22b-A377N，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliDH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過Amp抗性篩選 陽性克隆，送南京金斯瑞生物公司測序鑒定。
[0037]A377N突變引物及PCR條件分別為
[0038]A377AsnL:5' -GGTGATTTGGCAAATAATAAC-3'
[0039]A377AsnR:5' -TATTATTTGCCAAATCACCA-3'
[0040] 上游擴(kuò)增片段（含有phr起始密碼子的片段）：95°C預(yù)變性5min;94°C30s， 58°C30s，72°Clmin30s循環(huán)30次，72°C充分延伸IOmin;下游擴(kuò)增片段（含有phr終止密 碼子的片段）：95°C預(yù)變性5min;94°C30s，58°C30s，72°CImin循環(huán)30次，72°C充分延伸 IOmin;PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠回收后再進(jìn)行融合PCR，融合片段：95°C預(yù)變性5min;94°C30s， 45°C30s，72°CImin循環(huán) 10 次；之后，94°C30s，60°C30s，72°C2min循環(huán) 30 次，72°C充分 延伸lOmin。擴(kuò)增的產(chǎn)物與載體pET22b分別經(jīng)Ndel、XhoI雙酶切之后，連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a。篩選陽性克隆，獲得表達(dá)質(zhì)粒pET22b-A377N。雙酶切鑒定后，送南京金斯瑞進(jìn)行測 序，序列比對發(fā)現(xiàn)377位突變成功。
[0041] 將突變成功的菌體，平板劃線，挑菌，搖菌，重提質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì) 胞，構(gòu)建工程