水稻抗褐飛虱QBph3和QBph4基因的分子標(biāo)記的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物分子標(biāo)記制備技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及到同時(shí)來(lái)源于導(dǎo)入系IR02W101 中兩個(gè)水稻抗褐飛虱基因QBph3和QBph4緊密連鎖的分子標(biāo)記的制備，以及所述的分子標(biāo) 記在水稻褐飛虱抗性育種和品種改良上的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻是我國(guó)的主要糧食作物，褐飛虱是目前活躍于東南亞稻區(qū)的主要害蟲(chóng)。它是 一種典型的刺吸式害蟲(chóng)，通過(guò)其口針吸食稻株韌皮部汁液，輕者引起水稻營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸受 阻，影響千粒重，重則引起稻株下部干枯、腐爛、倒癱，稱之為"虱燒"，導(dǎo)致水稻大面積減產(chǎn) 甚至絕收。目前防治褐飛虱主要依靠化學(xué)殺蟲(chóng)劑，但是這種方法費(fèi)時(shí)費(fèi)工，且污染環(huán)境。同 時(shí)，殺蟲(chóng)劑的過(guò)量使用還會(huì)殺死其天敵及增強(qiáng)抗藥性，最終會(huì)引起飛虱的再次猖獗。利用水 稻自身的抗性基因來(lái)培育抗蟲(chóng)品種是目前最為經(jīng)濟(jì)有效的防控褐飛虱的方法。
[0003] 迄今，已經(jīng)在秈稻和野生稻中共發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了至少29個(gè)褐飛虱抗性基因（Wuet al. 2014)。其中有 14 個(gè)基因（Bphl、bph2、Bph3、Bph6、Bph9、Bphl2、Bphl4、Bphl5、Bphl8、 Bphl9、Bph20、Bph21、Bph27和Bph28)已經(jīng)應(yīng)用分子標(biāo)記精細(xì)定位到水稻染色體某一特定 區(qū)段內(nèi)。最近一個(gè)較大的進(jìn)展是Bphl4的克隆，該基因?qū)儆贑C-NBS-LRR基因家族，編碼的 蛋白質(zhì)與植物抗病性相關(guān)（Duetal. 2009)。但是褐飛虱抗性基因的遺傳基礎(chǔ)研究依然進(jìn) 展緩慢，而可供育種應(yīng)用的基因更是少之甚少。因此迫切需要挖掘更多的優(yōu)良抗性基因，并 將其導(dǎo)入到常規(guī)品種中以增強(qiáng)其褐飛虱抗性。
[0004] 一般來(lái)說(shuō)，野生稻中富含優(yōu)良的抗性基因，特別是褐飛虱抗性基因。但是野生稻往 往帶有其它不良性狀，且由于與栽培稻親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，很難與栽培稻雜交或是雜交后代種 子育性較低甚至不育。因此直接利用野生稻中的抗性基因?qū)㈦y于操作。通過(guò)回交育種和抗 性篩選將野生稻中的抗性基因?qū)氲皆耘喾N中，獲得一系列抗性明顯改良的導(dǎo)入系，并通 過(guò)感蟲(chóng)親本與導(dǎo)入系雜交構(gòu)建F2分離群體，結(jié)合分子標(biāo)記遺傳圖譜來(lái)定位褐飛虱抗性基因 是目前從野生稻中發(fā)掘褐飛虱抗性基因的一種有效方法。目前已利用導(dǎo)入系定位了很多來(lái) 自野生稻的優(yōu)良抗性基因，如來(lái)自于小粒野生稻的Bph20、Bph21 (Rahman et al. 2009)，來(lái)自 于澳洲野生稻的BphlO、Bphl8 (Ishii et al. 1994 ; Jena et al. 2006)，來(lái)自于藥用野生稻的 Bphl4> Bphl5> bphll> Bphl3 (Huang et al. 2001 ；Hirabayashi et al. 1998 ；Renganayaki et al. 2002)等。
[0005] 目前，只有很少的褐飛虱抗性基因被用于水稻育種而在生產(chǎn)上應(yīng)用。且已有證據(jù) 表明單個(gè)主效抗性基因的導(dǎo)入并不能持久解決褐飛虱逐年爆發(fā)的問(wèn)題。多個(gè)抗性基因的 聚合以及輪換能夠獲得持久抗性，并有效地遏制褐飛虱頻繁爆發(fā)。由于抗蟲(chóng)性鑒定的復(fù)雜 性，利用常規(guī)育種手段往往難以有效導(dǎo)入或聚合多個(gè)抗褐飛虱基因以培育抗蟲(chóng)品種。本發(fā) 明通過(guò)構(gòu)建遺傳群體和發(fā)展分子標(biāo)記，成功發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的褐飛虱抗性基因，并開(kāi)發(fā)了一 系列與抗性基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記，借助分子標(biāo)記輔助選擇（Marker-assisted selection，MAS)技術(shù)可以有目的地將抗蟲(chóng)基因精確導(dǎo)入和聚合，從而高效率快速選育持久 抗褐飛虱品種，有效抑制褐飛虱種群數(shù)量，節(jié)約人工和農(nóng)藥成本，保持水稻穩(wěn)產(chǎn)和增產(chǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種水稻抗褐飛虱主效基因新位點(diǎn)QBph3和QBph4的分子標(biāo) 記，通過(guò)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)與這些抗性基因位點(diǎn)連鎖或共分離的分子標(biāo)記，可以在苗期就能準(zhǔn)確預(yù) 測(cè)水稻植株的褐飛虱抗性，從而加快褐飛虱抗性水稻品種的選擇。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 申請(qǐng)人通過(guò)是篩選獲得一個(gè)水稻抗褐飛虱主效基因QBph3的分子標(biāo)記，它由下述 之一的引物對(duì)通過(guò)PCR程序擴(kuò)增獲得，所述的引物對(duì)的DNA序列如下所示：
[0009] 1)標(biāo)記引物ql，
[0024] 申請(qǐng)人通過(guò)篩選在上述同一材料中獲得另一個(gè)水稻抗褐飛虱主效基因QBph4的 分子標(biāo)記，其由下述之一的引物對(duì)通過(guò)PCR程序擴(kuò)增獲得，所述的引物對(duì)的DNA序列如下所 示：

[0055] 顯然上述兩個(gè)分子標(biāo)記可應(yīng)用于選育抗褐飛虱水稻的遺傳改良中。
[0056] 申請(qǐng)人提供了一種篩選水稻抗褐飛虱主效基因QBph3的分子標(biāo)記方法，其要點(diǎn) 是：利用上述涉及主效基因QBph3的引物對(duì)擴(kuò)增待檢水稻基因組DNA，并檢測(cè)所得的擴(kuò)增產(chǎn) 物，若利用標(biāo)記引物ql能擴(kuò)增出134bp的DNA片段，或利用標(biāo)記引物m3能擴(kuò)增出85bp的 DNA片段，或是利用標(biāo)記引物t6能擴(kuò)增出1197bp的DNA片段，或是利用標(biāo)記引物c3-14能 擴(kuò)增出242bp的DNA片段，或是利用標(biāo)記引物f3能擴(kuò)增出133bp的DNA片段，均標(biāo)志著水 稻抗蟲(chóng)導(dǎo)入系IR02W101抗褐飛虱基因位點(diǎn)QBph3的存在。QBph3被精細(xì)定位在水稻第3染 色體長(zhǎng)臂t6和f3之間，與C3-14共分離，因此利用標(biāo)記C3-14篩選目的基因的單株效率最 高，其它標(biāo)記如ql和m3均能用于篩選含有目的基因的抗褐飛虱水稻品種。
[0057] 與此同時(shí)，申請(qǐng)人提供了另一種篩選水稻抗褐飛虱主效基因QBph4分子標(biāo)記方 法，其要點(diǎn)是：利用上述基因QBph4構(gòu)建的引物對(duì)擴(kuò)增待檢水稻基因組DNA，并檢測(cè)所得的 擴(kuò)增產(chǎn)物，若利用標(biāo)記引物J409能擴(kuò)增出137bp的DNA片段，或是利用標(biāo)記引物p6能擴(kuò)增 出141bp的DNA片段，或是利用標(biāo)記引物p9能擴(kuò)增出145bp的DNA片段，或是利用標(biāo)記引物 P17能擴(kuò)增出168bp的DNA片段，或是利用標(biāo)記引物xc4-27能擴(kuò)增出207bp的DNA片段，或 是利用標(biāo)記引物c4-5能擴(kuò)增出133bp的DNA片段，或是利用標(biāo)記引物xc4-7能擴(kuò)增出118bp 的DNA片段，或是利用標(biāo)記引物HJ16能擴(kuò)增出152bp的DNA片段，或是利用標(biāo)記引物J417 能擴(kuò)增出136bp的DNA片段，或是利用標(biāo)記引物IN156能擴(kuò)增出173bp的DNA片段，均標(biāo)志 著水稻抗蟲(chóng)導(dǎo)入系IR02W101抗褐飛虱基因位點(diǎn)QBph4的存在。QBph4被精細(xì)定位在水稻第 4染色體短臂P17和xc4-27之間，也就是說(shuō)這兩個(gè)標(biāo)記與褐飛虱抗性基因QBph4距離最近， 利用這兩個(gè)標(biāo)記篩選目的基因的單株可靠性最高，其它分子標(biāo)記均能用于篩選該目的基因 的單株。
[0058] 此外，申請(qǐng)人還提出了利用主效基因QBph3和QBph4構(gòu)建的的分子標(biāo)記在水稻改 良中的應(yīng)用的方法，該方法在于用于篩選褐飛虱抗性水稻：在雜交分離后代中，利用上述QBph3的緊密連鎖標(biāo)記引物（如C3-14)擴(kuò)增待檢水稻的基因組DNA，并檢測(cè)所得的擴(kuò)增產(chǎn) 物，若擴(kuò)增產(chǎn)物的片段與上述檢測(cè)的一致，均標(biāo)志著雜交后代中存在QBph3位點(diǎn)；或/和通 過(guò)QBph4緊密連鎖標(biāo)記引物（如xc4-27)擴(kuò)增后代單株的DNA，若擴(kuò)增產(chǎn)物的片段與上述檢 測(cè)的一致，均標(biāo)志著雜交后代中存在QBph4位點(diǎn)。
[0059] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0060] (1)本發(fā)明首次在水稻抗褐飛虱導(dǎo)入系IR02W101中利用分子標(biāo)記精細(xì)定位了兩 個(gè)新主效抗性基因QBph3和QBph4。
[0061] (2)本發(fā)明中與抗性基因緊密連鎖或共分離的分子標(biāo)記可靠性高，鑒定方便。這些 分子標(biāo)記都是在堅(jiān)實(shí)的遺傳實(shí)驗(yàn)結(jié)果上驗(yàn)證的，且引物特異性高，多態(tài)性廣，可操作性強(qiáng)， 擴(kuò)增出的目標(biāo)片段單一，容易檢測(cè)。因此只要通過(guò)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)這些分子標(biāo)記，就可以準(zhǔn) 確預(yù)測(cè)水稻植株中褐飛虱抗性的存在與否，進(jìn)而預(yù)測(cè)其褐飛虱抗性，不受環(huán)境影響，檢測(cè)方 便、快捷、高效。
[0062] (3)本發(fā)明可以大大提高常規(guī)育種的輔助選擇效率，節(jié)約成本。常規(guī)育種特別是抗 性育種中，經(jīng)常是通過(guò)表型選擇來(lái)篩選抗性單株用于后續(xù)的雜交或回交轉(zhuǎn)育。但是水稻的 褐飛虱抗性鑒定程序非常復(fù)雜，同時(shí)受到環(huán)境和人力財(cái)力的限制。比如，在抗性鑒定之前， 要先準(zhǔn)備蟲(chóng)源并飼養(yǎng)褐飛虱群體；在人工接蟲(chóng)前還要保證褐飛虱群體單一、生物型一致、蟲(chóng) 齡適當(dāng)一致并與秧苗同步；此外接蟲(chóng)后還要用紗網(wǎng)罩住，控制室內(nèi)濕度和溫度，防雨防風(fēng)防 天敵；最后鑒定標(biāo)準(zhǔn)大多是肉眼觀察，主觀性太強(qiáng)，可靠性就很低。因此利用常規(guī)手段進(jìn)行 抗性育種難度較大，成本高。然而通過(guò)分子標(biāo)記檢測(cè)水稻植株中的褐飛虱抗性基因位點(diǎn)，僅 在苗期就能快速鑒定出高抗純合基因型的單株，及時(shí)淘汰感蟲(chóng)單株，不僅節(jié)約生產(chǎn)成本，而 且大大提高抗性材料的選擇效率，極大地縮短水稻品種的育種周期。
【附圖說(shuō)明】
[0063]圖1.本發(fā)明的總體技術(shù)路線圖。
[0064] 圖2.親本珍汕97B和IR02W101以及BC1F1和BC1F2的抗性分?jǐn)?shù)次數(shù)頻率分布圖。 圖中標(biāo)記：A，接蟲(chóng)10天后。B，接蟲(chóng)12天后。
[0065] 圖3.水稻品種IR02W101抗褐飛虱主效基因QBph3在第3染色體上的定位。圖中 標(biāo)記：A