一種鑒定水稻W(wǎng)x-mw基因的方法及其在優(yōu)質(zhì)水稻培育中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鑒定水稻低直鏈淀粉含量突變基因 Wx-mw不同基因型的四引物PCR分子標(biāo)記方法以及利用該分子標(biāo)記培育具優(yōu)良食味品質(zhì)水 稻品種的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻作為我國乃至世界范圍內(nèi)的重要糧食作物對保障我國糧食安全具有重要的 作用。近幾十年來，我國水稻產(chǎn)量不斷提高，尤其是隨著國民消費(fèi)水平和生活品味的提高， 對多樣化優(yōu)質(zhì)稻米的需求越來越多。
[0003] 稻米品質(zhì)表現(xiàn)為多樣性，就優(yōu)質(zhì)食用而言，主要包括碾磨品質(zhì)、外觀品質(zhì)、蒸煮與 食味品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)四個(gè)方面，這些品質(zhì)性狀直接決定了稻米的商品價(jià)值和消費(fèi)者的消費(fèi) 行為。蒸煮與食味品質(zhì)稻米品質(zhì)構(gòu)成中的最重要方面，由于胚乳是稻米的主要食用部分，而 其中的淀粉又是其主要組份。因此，淀粉的組成與結(jié)構(gòu)尤其是直鏈淀粉的含量是決定稻米 蒸煮與食味品質(zhì)的最重要因素（Tian等，PNAS. 2009(51)21760-21765)。
[0004] 由水稻蠟質(zhì)基因（Waxy，Wx)編碼的顆粒結(jié)合淀粉合成酶GBSSI主要負(fù)責(zé) 直鏈淀粉的合成，該基因的不同等位變異決定了稻米直鏈淀粉含量的多少（Wang等， PlantJournal. 1995(4) 613-622)。截止目前至少有7個(gè)已發(fā)表的Wx等位基因。在 懦稻中，由于第二外顯子中缺失23bp造成了wx轉(zhuǎn)錄提前終止（Wanchana等，Plant Science. 2003 (6) 1193-1199)。在非糯品種中，Wx基因主要分化為Wx-a和Wx-b兩種等 位類型。其中，攜帶Wx-a的稻米直鏈淀粉含量都很高（25%以上），屬于高直鏈淀粉類 型。Wx-b主要分布在粳稻品種中，攜帶該基因稻米的直鏈淀粉含量屬中等至較低水平 (15-18%左右）。與Wx-a相比，Wx-b的變異是由第一內(nèi)含子剪接位點(diǎn)處G-T變異造成的， 突變降低了前體mRNA的剪接效率從而減少了GBSSI的量進(jìn)而導(dǎo)致了較低的直鏈淀粉含量 (Wang等，PlantJournal. 1995(4)613-622)。此外，Mikami等克隆了Wx_in等位基因，證 明在第六外顯子上發(fā)生的A-C變異使直鏈淀粉含量降至中等水平（18-20% ) (Mikami等， TheorApplGenet. 2008(7)979-989)。除了上述常規(guī)等位基因外，還有3個(gè)"暗胚乳基因" 被克隆，即Wx-mq、Wx-mp和Wx_op。與Wx_b相比，Wx-mq在第四和第五外顯子處存在兩處 突變，導(dǎo)致直鏈淀粉含量降到10 %左右（Sato等，BreedingResearch. 2001 (3) 13-19)。 等位基因Wx-mp，是在Wx-mq基礎(chǔ)上第五外顯子發(fā)生了回復(fù)突變，攜帶該等位基因的稻米 直鏈淀粉含量也在10%左右（Yang等，PlantBreeding.2013(6)595-603)。另一個(gè)軟米 基因?yàn)閃x-〇p(或者Wx-hp)是由第4外顯子的A-G突變造成的（Mikami等，TheorAppl Genet. 2008(7)979-989)。
[0005] 低直鏈淀粉含量基因是進(jìn)行低直鏈淀粉水稻品種選育的重要遺傳資源。在水稻 中，攜帶暗胚乳基因Wx-mp、Wx_mq和Wx-op的稻米具有非常好的食味表現(xiàn)。利用這些等位基 因，目前已選育出了很多具有優(yōu)良食味品質(zhì)的優(yōu)質(zhì)稻米，如江蘇最好吃大米"南粳46"（王 才林等，中國水稻科學(xué).2009, 23 (I) 25-30)。然而由于直鏈淀粉含量較低，這類稻米在 含水量低的時(shí)候表現(xiàn)為云霧狀、乳白色、透明度差等暗胚乳的特性（SatoH等，Breeding Sci，2002, 52(2) 131-135)，嚴(yán)重影響了稻米的外觀品質(zhì)。因此，通過挖掘特定的Wx等位變 異基因，使得稻米在適當(dāng)降低直鏈淀粉含量、具有優(yōu)良食味表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，保持優(yōu)良的外觀 品質(zhì)，是水稻品質(zhì)改良的重要基礎(chǔ)。
[0006] 發(fā)明人在前期研究中分離克隆了水稻中一個(gè)新的控制低直鏈淀粉含量的Wx等位 基因Wx-mw，該基因來源于秈稻品種魔王谷。通過直鏈淀粉測定，攜帶Wx-mw的水稻直鏈淀 粉含量在13%左右，顯著低于含Wx-b的常規(guī)水稻品種、但略高于暗胚乳稻米（10%左右）。 因此，Wx-mw在優(yōu)良食味稻米新品種的培育中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0007] 目前，基于DNA變異的分子標(biāo)記在水稻遺傳改良中發(fā)揮了非常重要的作用。在水 稻品質(zhì)改良研究方面，不同的研究者已針對不同的Wx等位基因開發(fā)出了相應(yīng)的分子標(biāo)記， 如分別針對第一內(nèi)含子和第六外顯子SNP變異位點(diǎn)開發(fā)出了基于限制性內(nèi)切酶的CAPS分 子標(biāo)記（Chen,JournalofCerealScience. 2008 (48) 781-788)，針對水稻暗胚乳突變基因 Wx-mq開發(fā)了顯性PCR分子標(biāo)記（Sato等，BreedingSci. 2002 (52) 131-135)和CAPS分子 標(biāo)記等（Chen等，RiceSci. 2009 (16) 106-110)。上述分子標(biāo)記尤其是CAPS標(biāo)記操作繁瑣， 且常常存在酶切不完全現(xiàn)象而造成難以準(zhǔn)確鑒定不同的基因型的現(xiàn)象。有關(guān)Wx-mw等位基 因目前并未見報(bào)道，也沒有相關(guān)分子標(biāo)記的開發(fā)。因此，建立一種基于PCR技術(shù)的快速、準(zhǔn) 確鑒定水稻低直鏈淀粉含量突變基因Wx-mw的分子標(biāo)記是加快該新等位基因在稻米品質(zhì) 改良應(yīng)用中的重要工具。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對發(fā)明人前期分離克隆的水稻中一個(gè)新的控制低直鏈淀粉含量突變基 因Wx-mw的特異突變位點(diǎn)，即在Wx第一內(nèi)含子剪切位點(diǎn)G和T的差異以及第六外顯子第62 個(gè)堿基位點(diǎn)上A和C的差異，開發(fā)出了一種基于四引物擴(kuò)增受阻突變體系PCR的特異分子 標(biāo)記，特異地用于鑒定Wx-mw基因。該分子標(biāo)記與低直鏈淀粉含量性狀完全連鎖，在水稻生 長的任何時(shí)期任何組織均可對其進(jìn)行基因型檢測。
[0009] 本發(fā)明公開了 Wx-mw等位基因第一內(nèi)含子第二個(gè)堿基和Wx-mw等位基因第六外顯 子62bp的堿基作為鑒定水稻W(wǎng)x-mw基因的分子標(biāo)記的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明還公開了一組用于鑒定水稻W(wǎng)x-mw基因的特異性引物，其特征在于，由下 列4對引物組成：
[0011] ⑴分子標(biāo)記1的兩對引物：
[0012]正向外引物Wx-mw-〇utl-F:5'-AAGTCGGmTGCmTGGIT-3'（SEQ IDNO. 1)，
[0013]反向外引物Wx_mw-〇utl-R:
[0014] 5'-CCCCTGGGTATGTTTCTCTAGACTCT-3'（SEQ IDNO. 2);
[0015]正向內(nèi)引物Wx-mw-inl-F:
[0016] 5,-TTCATCAGGAAGAACATCTGCTAGG-3,（SEQ IDNO. 3)，
[0017]反向內(nèi)引物Wx-mw-inl-R:5' -GGAAACAAAGAATTATAAACAAATATGTAGAA-3'（SEQ ID NO. 4)；
[0018] 所述分子標(biāo)記I是指Wx-mw等位基因第一內(nèi)含子第二個(gè)堿基位點(diǎn)；
[0019] (2)分子標(biāo)記2的兩對引物如下：鑒定Wx-mw與Wx-a/b/mq/mq/op的兩對正向外
[0020] 反向外引物Wx-mw-〇ut2-R:5'-GTAGATGCCAITGGGCTGGTAGT-3'（SEQIDNO. 6)
[0021] 正向內(nèi)引物Wx-mw-in2-F: 5' -AACAACCCATACTTCAAAGGAACATC-3'（SEQIDNO. 7)
[0022] 反向內(nèi)引物Wx-mw_in2-R:
[0023] 5,-TCTTGAGATCAATTGTAACTCCCCAT-3,（SEQIDNO. 8);
[0024] 所述分子標(biāo)記2是指Wx-mw等位基因第六外顯子62bp的堿基位點(diǎn)。
[0025] 本發(fā)明還提供了一種鑒定水稻W(wǎng)x-mw基因的方法，用上述的4對引物擴(kuò)增水稻品 種的基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在紫外光下觀察DNA條帶的大小來鑒定Wx-