通過(guò)移碼位點(diǎn)上游調(diào)控因子來(lái)控制核糖體閱讀框改變效率以調(diào)控真核基因表達(dá)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明關(guān)于一種通過(guò)標(biāo)靶移碼位點(diǎn)上游調(diào)控因子，以調(diào)控真核基因表達(dá)的方法。 更特別地，本發(fā)明關(guān)于一種通過(guò)控制位于程序性核糖體移碼（PRF，programmedribosomal frameshifting)位點(diǎn)上游的雙螺旋結(jié)構(gòu)形成，來(lái)調(diào)控真核基因表達(dá)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然界已發(fā)現(xiàn)，動(dòng)態(tài)的RNA構(gòu)型交替轉(zhuǎn)變可以調(diào)控具有RNA-依賴(lài)性的細(xì)胞功 能。此調(diào)控作用通過(guò)在RNA所介導(dǎo)的特定功能性平臺(tái)內(nèi)，調(diào)控特別的RNA結(jié)構(gòu)形成來(lái) 達(dá)成（Dethoff，E.A.etal.,Nature482,322-330,2012)。已知原核細(xì)胞會(huì)利用核糖 開(kāi)關(guān)（Riboswitch，一種對(duì)代謝物產(chǎn)生感應(yīng)的RNA分子），來(lái)調(diào)控用于回應(yīng)養(yǎng)分變化的 特殊基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄終止或翻譯啟動(dòng)（Henkin,T.M.Genes&Dev. 22, 3383-3390, 2008 ; Mandal,M. &Breaker,R.R.NatureRev.Mol.CellBiol. 5, 451-463, 2004) 〇
[0003] 過(guò)去已有許多找尋一種能夠在原核及真核細(xì)胞系統(tǒng)中，引發(fā)由核糖開(kāi)關(guān)介導(dǎo)的基 因表達(dá)的化學(xué)結(jié)構(gòu)的嘗試（Deigan，K.E.等人，Acc.Chem.Res.44，1329-1338,2011)。然 而在哺乳類(lèi)細(xì)胞中核糖開(kāi)關(guān)應(yīng)用方面的成功案例則很有限，這可能與哺乳動(dòng)物系統(tǒng)使用 與原核細(xì)胞不同的機(jī)制來(lái)終止轉(zhuǎn)錄作用，及啟動(dòng)翻譯作用有關(guān)。此外在真菌與植物中所 發(fā)現(xiàn)由TPP核糖開(kāi)關(guān)執(zhí)行的另類(lèi)剪接（splicing)調(diào)節(jié)作用（Cheah，M.T.etal.，Nature 447, 497-500, 2007)，也暗示其他由RNA介導(dǎo)的基因表達(dá)平臺(tái)，或可提供較佳用于建構(gòu)成功 的真核細(xì)胞核糖開(kāi)關(guān)的架構(gòu)。
[0004] -1程序性核糖體移碼（PRF)會(huì)促使翻譯延長(zhǎng)階段中的核糖體往mRNA的5'端-方 向位移一個(gè)核苷酸，導(dǎo)致在解碼時(shí)產(chǎn)生一個(gè)-1閱讀框改變。有效的-IPRF需要一段滑動(dòng)序 列（即，發(fā)生框架位移之處），以及置于其下游的刺激子結(jié)構(gòu)（通常是一種假結(jié)結(jié)構(gòu)）。反 之，+IPRF會(huì)促使翻譯延長(zhǎng)階段中的核糖體往mRNA的3'端-方向位移一個(gè)核苷酸，導(dǎo)致在 解碼時(shí)產(chǎn)生一個(gè) +1 閱讀框改變（Farabaugh,P.J.，Microbiol.Rev. 60, 103-134, 1996)。
[0005] 最近的結(jié)果顯示，原核細(xì)胞來(lái)源的經(jīng)改造的代謝物-感應(yīng)性RNA假結(jié)，在網(wǎng)狀 紅血球細(xì)胞溶解產(chǎn)物中可以具有配體-特異性的-1程序性核糖體移碼（-1PRF)的活 性。雖然這些成功的例子，暗示調(diào)節(jié)翻譯閱讀框改變可作為一種運(yùn)用于改造哺乳類(lèi)細(xì)胞 核糖開(kāi)關(guān)的表達(dá)平臺(tái)，但其一般應(yīng)用則仍因?yàn)殡y以鑒定出專(zhuān)一的配體-感應(yīng)性的-IPRF 假結(jié)而受到阻礙（Chou，M.Y.等人RNA16，1236-1244,2010;Yu，C.H.等人403〇16111. Biol. 8, 733-740, 2013)。
[0006] -IPRF對(duì)于數(shù)種人類(lèi)病毒病原能在宿主內(nèi)有效進(jìn)行復(fù)制而言是相當(dāng)重要的，且已 被認(rèn)為是一種抗病毒標(biāo)靶（Hung,M.等人J.Virol. 72, 4819-4824, 1998)。通過(guò)可阻斷-IPRF 刺激子功能性的配體作用來(lái)抑制病毒的-1PRF，病毒的移碼位點(diǎn)下游-IPRF刺激子結(jié)構(gòu)因 此可作為一種有效的藥物標(biāo)靶。所述的配體可為能與該刺激子結(jié)構(gòu)專(zhuān)一結(jié)合的有機(jī)分子 (Park.S.-J.etal,J.Am.Chem.Soc.133,10094-10100, 2011)，或是可破壞該刺激子結(jié)構(gòu) 的反義序列（Ahn，D.-G.etal,AntiviralRes.91, 1-10,2011)。使用反義序列來(lái)祀定下 游刺激子結(jié)構(gòu)的可能缺點(diǎn)在于，mRNA與反義序列之間所形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)，當(dāng)被放置于移 碼位點(diǎn)的下游時(shí)，本身會(huì)刺激-IPRF(Olsthoorn，R.C.L.等人，RNA10, 1702-1703, 2004 ; Howard,M.T.etal.RNA10, 1653-1661，2004)。我們先前的研究已顯示，位于-IPRF滑動(dòng)點(diǎn) 上游的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以減弱-IPRF效率。而減弱效率由發(fā)夾結(jié)構(gòu)安定性及其與滑動(dòng)點(diǎn)的距 離來(lái)決定。此外，當(dāng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)置于+1移碼位點(diǎn)的上游時(shí)，也能夠刺激酵母菌的+1PRF，表示 位于移碼位點(diǎn)上游近端的安定發(fā)夾結(jié)構(gòu)確實(shí)也是一種核糖體閱讀框改變的調(diào)節(jié)子（Cho,C. P.等人，PLoSONE8,e62283, 2013)。
[0007] 需注意的是，此類(lèi)共-翻譯再折疊RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)讓人聯(lián)想到，原核細(xì)胞系統(tǒng)中可調(diào) 節(jié)與P-無(wú)關(guān)的轉(zhuǎn)錄終止效率的共-轉(zhuǎn)錄再折疊RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，我們因此推論該調(diào)節(jié)性移 碼位點(diǎn)上游發(fā)夾結(jié)構(gòu)可能可以，以與原核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄終止作用中的發(fā)夾結(jié)構(gòu)類(lèi)似的方式受到 調(diào)控。因此意味著，除了使用下游配體-感應(yīng)性假結(jié)刺激子之外，通過(guò)配體-依賴(lài)性調(diào)節(jié)上 游減弱子發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成，也可提供另類(lèi)建構(gòu)具有配體-感應(yīng)性的-IPRF調(diào)節(jié)回路的方法。
[0008] 在試圖解析上游發(fā)夾結(jié)構(gòu)在核糖體閱讀框改變的調(diào)節(jié)作用中所扮演的角色的過(guò) 程中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)與-IPRF移碼位點(diǎn)上游mRNA序列互補(bǔ)的反義序列，也可減量調(diào)節(jié)-IPRF活 性，此暗示被解旋后再形成的發(fā)夾主干部位為調(diào)節(jié)翻譯軌道移轉(zhuǎn)的功能性決定位。因此， mRNA中近端穩(wěn)定的發(fā)夾結(jié)構(gòu)以及由反式作用的反義序列介導(dǎo)的雙螺旋結(jié)構(gòu)，當(dāng)其被置于緊 鄰移碼位點(diǎn)上游近端時(shí)，可作用為閱讀框改變的調(diào)節(jié)子。相反地，核糖體移碼位點(diǎn)上游由 mRNA與原核16S核糖體RNA之間的內(nèi)部Shine-Dalgarno(SD)-反SD交互作用所介導(dǎo)的短 雙螺旋結(jié)構(gòu)，可刺激原核細(xì)胞的-1及+IPRF(Weiss,R.B.等人，EMBOJ. 7, 1503-1507, 1988 ; Larsen,B.等人，J.Bacteriol. 176,6842-6851，1994)。然而，在真核細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中并未 發(fā)現(xiàn)SD-反SD交互作用的存在。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的一方面關(guān)于一種標(biāo)靶位于移碼位點(diǎn)上游的調(diào)節(jié)元件來(lái)調(diào)節(jié)真核細(xì)胞基 因表達(dá)的組成物，其包含調(diào)控于核糖體移碼位點(diǎn)上游的雙螺旋結(jié)構(gòu)形成的配體分子。
[0010] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施形式，所述的調(diào)節(jié)真核細(xì)胞基因表達(dá)的組成物包含：一 種配體-敏感性RNA元件，來(lái)調(diào)節(jié)上游-1程序性核糖體移碼減弱子發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。在本 發(fā)明的一些具體實(shí)施形式，所述的真核細(xì)胞為植物細(xì)胞。在本發(fā)明的其他具體實(shí)施形式，所 述的真核細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0011] 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施形式，所述的調(diào)控PRF上游調(diào)節(jié)性發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成包括， 增進(jìn)或抑制該發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。在本發(fā)明的一項(xiàng)具體實(shí)施例，所述的程序性核糖體移碼 為-1PRF。在本發(fā)明的另一項(xiàng)具體實(shí)施例，所述的程序性核糖體移碼為+1PRF。
[0012] 在本發(fā)明的一項(xiàng)具體實(shí)施例，所述的閱讀框改變的調(diào)節(jié)作用可通過(guò)一種與移碼位 點(diǎn)上游的mRNA序列互補(bǔ)，而形成上游雙螺旋結(jié)構(gòu)的反義序列來(lái)達(dá)成。
[0013] 在本發(fā)明的一項(xiàng)具體實(shí)施例，所述的配體為一種與位于基因的mRNA中的PRF上游 調(diào)節(jié)性發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成序列互補(bǔ)的反義序列。在本發(fā)明的另一項(xiàng)具體實(shí)施例，所述的配體為 一種與位于基因的mRNA中的PRF上游調(diào)節(jié)性發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成序列相結(jié)合的分子。
[0014] 在本發(fā)明的又一項(xiàng)具體實(shí)施例，所述的配體為一種與位于基因的mRNA中的PRF上 游調(diào)節(jié)性發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成序列相結(jié)合的RNA-結(jié)合蛋白。在本發(fā)明的另一項(xiàng)具體實(shí)施例，所述 的配體為一種與位于基因的mRNA中的PRF上游調(diào)節(jié)性發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成序列相結(jié)合的有機(jī)化 合物。
[0015] 在另一方面，本發(fā)明關(guān)于一種調(diào)節(jié)真核細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯過(guò)程中核糖體移碼效率的 方法，包含將真核細(xì)胞與一種用于調(diào)節(jié)PRF上游調(diào)節(jié)性雙螺旋結(jié)構(gòu)元件形成的分子接觸。 在本發(fā)明的一些具體實(shí)施形式，所述的真核細(xì)胞為植物細(xì)胞。在本發(fā)明的其他具體實(shí)施形 式，所述的真核細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0016] 在本發(fā)明的一項(xiàng)具體實(shí)施例，所述的分子為一種RNA-結(jié)合蛋白。在本發(fā)明的另一 項(xiàng)具體實(shí)施例，所述的分子為一種有機(jī)化合物。在本發(fā)明的又一項(xiàng)具體實(shí)施例，所述的分子 為一種反義序列。
[0017] 本發(fā)明的有益效果為：
[0018] 本發(fā)明揭露的用于調(diào)節(jié)上游-IPRF減弱子或+IPRF刺激子的配體的概念、設(shè)計(jì)及 應(yīng)用，證明共-翻譯再折疊RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)對(duì)于核糖體閱讀框改變調(diào)控的配體-依賴(lài)性調(diào)節(jié) 潛能，可從旁避開(kāi)對(duì)于尋找配體_感應(yīng)性假結(jié)的需求。
[0019] 此