Ubxn1基因啟動子區(qū)突變位點及其在檢測豬肉系水力上的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及UBXNl基因啟動子區(qū)突變位點及其在檢測豬肉 系水力上的應用。
【背景技術】
[0002] 泛素是真核細胞中廣泛存在并且序列高度保守的小蛋白，由76個氨基酸殘基組 成，它的主要功能是標記需要分解的蛋白質，使其被水解。當附有泛素的蛋白質移動到桶狀 的蛋白酶的時候，由泛素-蛋白酶體途徑介導使該蛋白質水解。負責執(zhí)行這個調控過程的 組成成分包括泛素及其啟動酶系統(tǒng)和蛋白酶體系統(tǒng)。泛素啟動酶系統(tǒng)負責活化泛素，并將 其結合到待降解的蛋白上，形成靶蛋白多聚泛素鏈，即泛素化。蛋白酶體系統(tǒng)可以識別已泛 素化的蛋白并將其降解。泛素_蛋白酶體途徑是較普遍的一種內源蛋白降解方式。不過后 來又發(fā)現(xiàn)，并非所有泛素化修飾都會導致降解。有些泛素化會改變蛋白的活性，導致其他的 生物效應。因此，蛋白質的泛素化作為細胞內的一種重要的翻譯后修飾，在蛋白質降解和質 量控制、內吞作用、膜泡運輸、細胞周期、DNA損傷修復、生長因子信號通路、基因的轉錄和沉 默等細胞生物學過程中發(fā)揮重要作用。此外，細胞內還有另一類解離泛素鏈分子的去泛素 化蛋白酶形成反向調節(jié)。
[0003]在宰后過程中，蛋白質的降解對于系水力水平高低影響是復雜的。一方面，肌肉中 蛋白質的降解會產生靜電作用使肌纖維將滲出細胞膜外的水分重新吸收，進而保持一定的 水分，使水分不輕易流失。另一方面，肌肉中蛋白質還能通過自身的降解為水分的儲存增加 一定的空間，此時部分水分又再次進入肌原纖維內，從而提高系水力的水平，因此，探討相 關基因對蛋白質降解的調節(jié)作用對于我們研究系水力也相當重要。
[0004]UBXNl(UBXdomain-containingprotein1)位于 2 號染色體，其包含多個數(shù)量性 狀遺傳位點，例如滴水損失、PH、導電性、熟肉率等。我們知道，泛素之所以能發(fā)揮如此廣泛 而又特異的作用是與泛素結合蛋白家族密切相關的，泛素的結合是由多種類型的泛素結合 結構域介導的，包含UBA(ubiquitin_associateddomain)結構域的蛋白是最大的家族，其 家族成員參與多種生理過程。而我們研究的UBXN1，它的N末端就含有一個可以與泛素結合 的UBA結構域，作為NF-KB信號通路的負調控子；它的C端具有一個與泛素具有弱同源性 的UBX結構域，它能夠結合泛素鏈，通過UBX結構域結合p97,參與泛素蛋白酶體途徑的調 控，從而可以調節(jié)骨骼肌蛋白質的降解，同時還參與負調控P97依賴的內質網相關的降解， 從而影響到肌肉的系水力水平。

【發(fā)明內容】

[0005]UBXNl可以作為一個與系水力相關的候選基因，發(fā)明人經過大量創(chuàng)造性勞動，篩選 出影響UBXNl表達的SNP位點，分析了SNP位點與豬系水力相關性，為進一步篩選選育標記 提供理論依據(jù)。
[0006] 本發(fā)明的目的通過以下技術方案實現(xiàn)
[0007]I.UBXNl基因啟動子區(qū)突變位點，該突變位點位于UBXNl基因啟動子區(qū)的轉錄起 始位點上游379bp處，具有多態(tài)性SNP位點，分別為鳥嘌呤G或胸腺嘧啶T。
[0008] 2.上述1提供的突變位點在檢測豬肉系水力上的應用，其中，該突變位點為鳥嘌 呤G的樣品系水力低于該突變位點為胸腺嘧啶T，根據(jù)UBXNl基因啟動子區(qū)的轉錄起始位點 上游379bp處的突變位點確定豬肉的系水力情況。
[0009] 3.上述1提供的突變位點在檢測豬肉系水力上的應用，該檢測方法包括如下步 驟：
[0010] 1)提取待檢測豬肉樣品的DNA，根據(jù)失水率篩選較高個體組和較低個體組樣品各 18個，較高組失水率平均值土標準誤（0. 3743±0. 0127)，較低組失水率平均值土標準誤 (0? 1133±0. 0014)，分別構建DNA樣品混池。
[0011] 2)以引物對：UBXNl-IF和UBXN1-1R、UBXN1-2F和UBXN1-2R、UBXN1-3F和 UBXN1-3R、UBXN1-4F和UBXN1-4R;對步驟1)獲得的DNA進行PCR擴增，獲得擴增片段；
[0012] 3)對擴增片段進行測序，測序由蘇州金唯智生物科技有限公司進行；
[0013] 4)分析測序結果，較高組混池測序后UBXNl基因啟動子區(qū)的轉錄起始位點上游 379bp處鳥嘌呤G占優(yōu)勢，較低組混池測序后胸腺嘧啶T占優(yōu)勢，也就是說如果位于UBXNl 基因啟動子區(qū)的轉錄起始位點上游379bp處的位點為鳥嘌呤G，則該待檢測豬肉樣品具有 相對較高的失水率，則說明該樣品系水力水平較低；如果379bp處的位點為胸腺嘧啶T，則 該待檢測豬肉樣品具有相對較低的失水率，則說明該樣品系水力水平較高；
[0014]其中，UBXNl-IF序列如：5'CATGAGGmTGGGITCGAT3'，
[0015]UBXNl-IR序列如：5'GGGmGCITTCTGAGGGA3' ；
[0016]UBXN1-2F序列如：5，GGGCTAAGCAGTCAACAA3'，
[0017]UBXN1-2R序列如：5'CTCCGTGAGAAGITCCTGT3' ；
[0018]UBXN1-3F序列如：5'CCAACGGAACGGCATCT3'，
[0019]UBXN1-3R序列如：5'AGCCAGITCCCGATACGAC3' ；
[0020] UBXN1-4F序列如：5，CAGAGGATGAGCAGGTCAAAGA3'，
[0021] UBXN1-4R序列如：5'CGGAAGTGCCCGAATCTGT3'。
[0022] 4.權利要求3所述的應用，其特征在于：步驟2)中PCR擴增反應50yL體系： 2XrTaq混合物 25yL、上下游引物各 2. 5yL、待檢測DNA2. 5yL、ddH2017. 5yL;
[0023]PCR反應程序：94°C5min;94°C30s、58-68°C30s退火、72°C30s、35 個循環(huán)； 72°C7min；
[0024] 5.權利要求4所述的應用，其特征在于：PCR反應程序中，退火溫度為：引物對 UBXNl-IF和UBXNl-IR58。(：；引物對UBXN1-2F和UBXN1-2R6(TC;UBXN1-3F和UBXN1-3R 62°C;UBXN1-4F和UBXN1-4R68°C。
[0025] 6.-種判斷豬肉系水力的方法，其特征在于，該檢測方法包括如下步驟：
[0026] 1)提取待檢測豬肉樣品的DNA;
[0027] 2)以引物對：(PU-F和PU-R對步驟1)獲得的DNA進行PCR擴增，獲得擴增片段；
[0028] 3)利用PCR-SSCP的方法分型，再挑選不同基因型樣品進行測序鑒定。
[0029] 5)根據(jù)PCR-SSCP分型結果，分析豬肉系水力，在UBXNl基因啟動子區(qū)的轉錄起始 位點上游379bp處基因型與失水率的關系為：GG型失水率（0. 2354±0. 02007)高于GT型 (0? 1973±0.01132)，GT型（0? 1973±0.01132)失水率高于IT型（0? 1878±0.01146)，以此 選擇系水力尚的豬肉樣品。
[0030]其中，PU-F的序列如：5'GGGCGGAGGATGGCTCAACT3'
[0031]PU-R的序列如：5'GCCACCGCTCCACATCCTCA3'
[0032] 7.權利要求6所述的應用，其特征在于：步驟2)中PCR擴增反應20yL體系： 2XrTaq混合物10yL、上下游引物各IyL、待檢測DNAlyL、CldH2O7yL;
[0033]PCR反應程序：94°C5min;94°C30s、68°C30s退火、72°C30s、35 個循環(huán)； 72°C7min；
[0034] 8.權利要求7所述的應用，其特征在于：PCR反應程序中，退火溫度為：引物對 PU-F和PU-R68 °C。
[0035] 有益效果
[0036]系水力的高低不僅會影響肉的水分含量、營養(yǎng)含量、肉的色澤等肉品質量，從而影 響了鮮肉的感官品質和食用品質，而且由于系水力較差的原因，在豬肉的生產、運輸過程中 將會造成嚴重的重量損失、經濟損失，所以提高系水力水平具有重要的經濟意義。
[0037] 本發(fā)明通過在候選基因UBXNl啟動子區(qū)篩選與失水率性狀相關的SNP位點，并擴 大樣本量進行基因分型驗證，將各個基因型與失水率性狀進行相關分析，確定基因型與失 水率性狀之間關聯(lián)性程度高低，從而獲得與系水力性狀相關的功能基因或分子遺傳標記。
【附圖說明】
[0038] 圖1豬肉失水率分組比較圖
[0039] 圖2UBXNl分別在失水率高低組mRNA表達水平
[0040] 圖3轉錄起始位點上游379bp處SNP突變位點模式
[0041] 其中，A圖是失水率H組突變位點模式，該位點為G;B圖是失水率L組突變位點模 式，該位點為T
[0042] 圖4突變位點基