置3個平行管反應(yīng)，以 0-action作為內(nèi)參。PCR程序為：95°C5min;35 個循環(huán)（95°C10s，60°C30s)
[0048]gga-miR-19b-3p定量的條件為：利用試劑盒方法進行反轉(zhuǎn)錄（miScriptIIRT Kit，Qiagen公司）和定量檢測（miScriptSYBRGreenPCRKit，Qiagen公司），其中 gga-miR-19b-3p擴增特異性引物為TGTGCAAATCCATGCAAAACTGA。
[0049]miRNA的表達檢測每次設(shè)置3個平行管反應(yīng)，以U6作為內(nèi)參。PCR程序為： 95。(： 15min;40 個循環(huán)（94。(： 15s，55°C30s，7(TC30s);
[0050] 統(tǒng)計學(xué)分析：采用SAS8.0軟件（SASInst.Cary,NC,USA)進行分析。統(tǒng)計方法均 數(shù)間比較采用t檢驗，P< 0.05(差異顯著）和P< 0.01(差異非常顯著）定為有統(tǒng)計學(xué) 意義，分析高、低表型組間表達差異。
[0051]qRT-PCR結(jié)果表明，miR-19b_3p在北京油雞高、低表型組中，差異極顯著 (p〈0. 01)，且差異倍數(shù)達到10倍以上（圖2) ;ACSL1也在在北京油雞高、低表型組中，差異 極顯著（圖3，p〈0.01)。
[0052] 實施例3miRNA gga-miR-19b-3p對前脂肪細胞發(fā)育及ACSLl基因表達的調(diào)控
[0053] 1)質(zhì)粒的構(gòu)建及miRNA的合成
[0054] ACSLl野生型載體構(gòu)建：根據(jù)Genbank上雞的ACSLl的3' UTR(NC_006091. 3)序 列設(shè)計引物，提取原雞血液中的DNA為模板，利用PCR方法，擴增ACSLl全長3' UTR序列。 經(jīng)回收、純化等步驟，將目的片段克隆到pmiR-RB-REP0RT?載體中。具體的實驗步驟包 括：對ACSLl全長3' UTR序列進行酶切位點分析，并根據(jù)載體序列信息，選擇XhoI和Not I兩個內(nèi)切酶切PCR產(chǎn)物；利用試劑盒進行目的片段的純化、酶切和回收；將PCR產(chǎn)物與 pmiR-RB-REPORT?載體連接；進行菌落PCR測序鑒定后獲得ACSLl野生型載體。
[0055] ACSLl突變型載體構(gòu)建：根據(jù)ACSL13'-UTR區(qū)域與對應(yīng)miRNA種子區(qū)域結(jié)合位點， 完成構(gòu)建突變載體。引物如下：
[0056] gga-ACSLl-mut_F ：CAACAAGGAAACGTGTAAGATTTGTGTGATTGT；
[0057] gga-ACSLl-mut_R :AAATCTTACACGTTTCCTTGTTGTGCTTGTATC。
[0058] 其中斜體加粗部分為突變位點序列。
[0059] 2)雙熒光素酶試驗驗證ACSLl與gga-miRNA-19b-3p的靶向結(jié)合
[0060] 以293T細胞為試驗載體，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將ACSLl雙熒光素酶野生型和突 變型表達載體和gga-miR-19b-3p的模擬物（mimics)分別共轉(zhuǎn)入細胞中。
[0061] 試驗分為對照組和試驗組。具體分組如下：1)對照組（NC)=Negative control(NC)和預(yù)測靶基因3' -UTR野生型表達載體的共轉(zhuǎn)染；2)miRNA超表達組： gga-miR-19b-3p模擬物和ACSLl表達載體共轉(zhuǎn)染。
[0062] 在轉(zhuǎn)染前一天，將細胞接種至96孔板培養(yǎng)板，當(dāng)細胞融合度達60 %時，即可進 行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染體系為l〇ul，具體轉(zhuǎn)染體系如下：試驗組：0. 5ul終濃度為50nM的模擬物 +50ngACSL13'-UTR表達載體 +0? 25ulFugene6 ;對照組：0? 5ul終濃度為 50nM的NC+50ng ACSL13'-UTR表達載體+0? 25ulFugene6,用opti-MEM培養(yǎng)基加至 10ul。
[0063] 轉(zhuǎn)染后24h，采用雙熒光素酶報告基因檢測過表達組和對照組的熒光素酶活性。圖 4結(jié)果表明，與對照組相比，共轉(zhuǎn)了gga-miR19b-3p模擬物和ACSLl野生型表達載體的試驗 組，熒光素酶的活性顯著下降。而將ACSLl與gga-miR19b-3p種子序列結(jié)合位點突變后，熒 光素酶的活性則沒有顯著變化。結(jié)果表明ACSLl是gga-miR19b-3p的靶基因。
[0064] 3) gga-miR-19b_3p對前脂肪細胞增值和分化的影響
[0065] 通過在前脂肪細胞中添加gga-miR-19b_3p模擬物的方法使得gga-miR-19b_3p過 表達。結(jié)果與陰性對照組相比，gga-miR-19b-3p的表達極顯著增加（p〈0. 001，圖5)。
[0066] 在前脂肪細胞培養(yǎng)基中加入50nm濃度的gga-miR-19b-3p模擬物進行培養(yǎng)。在增 殖和分化的不同時間點，通過MTT法和油紅0法分別檢測前脂肪細胞的增殖和脂肪細胞脂 滴沉積變化，結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染后48小時，gga-miR-19b-3p模擬物添加組細胞數(shù)量顯著高 于對照組化〈〇.〇1，圖6);而脂滴沉積在轉(zhuǎn)染88&-1^1?-1%-3?模擬物24,48， &11(172小時 三個時間點均顯著高于對照組（p〈0.Ol或p〈0. 001，圖7)。試驗證明gga-miR-19b_3p可促 進前脂肪細胞增值和分化，促進脂肪沉積。
[0067] 實施例4檢測雞腹脂組織中g(shù)ga-miR-19b_3p表達水平的熒光定量PCR試劑盒。
[0068] 所述試劑盒包括：反轉(zhuǎn)錄試劑、目的miRNA的特異性上游引物、內(nèi)參引物和熒光定 量PCR反應(yīng)液。
[0069]反轉(zhuǎn)錄試劑：購自Qiagen公司的miScriptIIReverseTranscriptionKit，貨號 218060 或 218161，具體成分為：miScriptReverseTranscriptaseMix，miScriptHiSpec Buffer。
[0070] 目的miRNA的特異性上游引物序列為TGTGCAAATCCATGCAAAACTGA。
[0071] 內(nèi)參引物為：CGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCCCTGTCTC
[0072]熒光定量PCR反應(yīng)液：購自Qiagen公司的miScriptSYBRGreenPCRKit，貨 號 218073 或 218075,具體成分為QuantiTectSYBRGreenPCRMasterMix，miScript UniversalPrimer。
[0073]所述試劑盒的工作程序為：95°C15min;94°C15s，55°C30s，70°C30s，40 個循環(huán)。
[0074] 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種與雞腹脂沉積相關(guān)的miRNA，其特征在于，所述miRNA的靶標基因是ACSLl。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的miRNA，其特征在于，所述miRNA為gga-miR-19b-3p，其核苷 酸序列如SEQ ID No. 1所示。3. 權(quán)利要求1或2所述的miRNA在調(diào)控前脂肪細胞增殖和分化中的應(yīng)用，其特征在于， 所述miRNA通過調(diào)控ACSLl基因的表達，調(diào)控前脂肪細胞的增殖和分化。4. 權(quán)利要求1或2所述的miRNA作為分子標記在遺傳標記輔助育種和改善雞腹脂沉積 中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用具體為通過檢測雞腹脂組織中 所述miRNA的表達水平，判斷雞腹脂重/率的高低從而進行篩選。6. 檢測權(quán)利要求1或2所述miRNA表達水平的方法，其特征在于，所述方法包括如下步 驟： (1) 提取待測雞腹脂組織中含有小RNA的總RNA ; (2) 通過poly (A)聚合酶在miRNA的3'末端加上多聚A，以互補的多聚T為3'引物， 利用反轉(zhuǎn)錄酶進行miRNA反轉(zhuǎn)錄； (3) 采用 miRNA 特異正向引物 TGTGCAAATCCATGCAAAAC TGA及適用于加尾法的熒光定量PCR試劑盒進行g(shù)ga-miR-19b-3p的擴增；擴增后利用 2 A Ae法計算獲得gga-miR-19b-3p表達水平。7. -種檢測雞腹脂組織中g(shù)ga-miR-19b-3p表達水平的熒光定量PCR試劑盒。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：反轉(zhuǎn)錄試劑、目的 miRNA的特異性上游引物、內(nèi)參引物和熒光定量PCR反應(yīng)液。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述目的miRNA的特異性上游引物序列 為 TGTGCAAATCCATGCAAAACTGA。
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子標記領(lǐng)域，具體提供一種與雞腹脂沉積相關(guān)的miRNA及其應(yīng)用。本發(fā)明利用高通量測序技術(shù)和miRNA-mRNA聯(lián)合分析，篩選到調(diào)控脂肪沉積關(guān)鍵基因ACSL1的一種miRNA，所述的miRNA為gga-miR-19b-3p，其核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。所述miRNA可作為與雞腹脂沉積相關(guān)的分子標記，在遺傳輔助育種中具有重要的實際應(yīng)用價值。
【IPC分類】C12N15/113, C12Q1/68
【公開號】CN105087584
【申請?zhí)枴緾N201510494475
【發(fā)明人】劉冉冉, 文杰, 趙桂蘋, 黃華云, 鄭麥青, 李慶賀
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年8月12日