②sibMEN-1轉染組；③sibMEN-2轉染組； ④sibMEN-3轉染組；⑤sibMEN-1/2/3轉染組。
[0034] 待6孔板中細胞生長至匯合度約70% -80%時刻進行轉染，轉染的具體操作步驟 如下：
[0035] (1)轉染前將6孔板中的培養(yǎng)基更換為無雙抗、10%FBS的培養(yǎng)基。
[0036] (2)預混OPTI-MEM與siRNAs:對于每孔細胞，使用150yIOPTI-MEM分別稀釋s iRNAs至終濃度為50nM，輕輕混勻后室溫孵育5min。
[0037] (3)預混OPTI-MEM與Lipofectamine2000:每孔細胞用 150yIOPTI-MEM稀釋 IOylLipofectamine2000轉染試劑，輕輕混勾后室溫孵育5min。
[0038](4)混合OPTI-MEM-siRNAs(步驟 2)和OPTI-MEM-Lipofectamine2000 (步驟 3)， 此時總體積是300y1，輕輕混勾并在室溫條件下放置20min，使siRNAs與Lipofectamine 2000形成有效復合物。
[0039] (5)在每一孔中逐滴輕輕加入300y1復合物，加完后采用十字交叉法輕輕搖動混 勻。
[0040] (6)將6孔細胞培養(yǎng)板置于37°C細胞培養(yǎng)箱中，5-6小時后更換培養(yǎng)基為完全培養(yǎng) 基。
[0041] (7)繼續(xù)培養(yǎng)24-72小時后收獲細胞提取總RNA及蛋白。
[0042] 實施例3實時熒光定量RT-PCR檢測牛MENlmRNA表達情況
[0043] 采用RNAsimpleTotalRNAKit總RNA提取試劑盒按照說明書提取實驗各組乳 腺上皮細胞的總RNA，采用I. 0%的普通瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，采用紫外分 光光度計法分別在260nm和280nm波長下檢測RNA的濃度及抽提純度。根據(jù)PrimeScript TMRTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)試劑盒的要求將總RNA反轉 錄為cDNA。
[0044] 以此為模板進行實時熒光定量PCR擴增，采用SYBRGreenI染料法，利用TaKaRa 公司的SYBRRPremixExTaqTM(PerfectRealTime)試劑盒在ABI7500儀器上進行實時 熒光定量PCR。
[0045] 所用MENl特異正義鏈引物核苷酸序列如SeqIDNo. 10 : 5' -gatggaggtggcatttatgg-3'所示，和MENl特異反義鏈引物核苷酸序列如SEQNO. 11所 示：5'-gatgtgctcatcccggtagt_3'所示。內(nèi)參照基因牛0-actin特異正義鏈引物核苷酸 序列如SEQNo.l2:5'-cccagcacaatgaagatcaa_3'所示、0-actin特異反義鏈引物核苷酸 序列如SEQNo. 13 :義5'-tagaagcatttgcggtggac_3'所示。MENlmRNA表達量的分析采用比 較Ct數(shù)據(jù)法（2_AA，進行。每組實驗重復3次。
[0046] 結果如圖1所示，檢測后的結果顯示：三個siRNAs都可以有效抑制牛MENl基因 的轉錄。轉染后24h，sibMEN-1/2/3轉染組相比對照組干擾效果最好，干擾效率達到80 %， 而sibMEN-1轉染組干擾效率約57%;在轉染后48h，干擾效果最好的是sibMEN-1轉染組， 干擾效率達到59%，sibMEN-1/2/3轉染組干擾效率約48% ;在轉染后72h，干擾效果最好 的是sibMEN-1轉染組，干擾效率達到73%，其余三組干擾效率相近，約67%。整體而言，s ibMEN-1與sibMEN-1/2/3的抑制效率最佳且相對穩(wěn)定。
[0047] 于是，在此預實驗的基礎上，又針對SibMEN-I和sibMEN-1/2/3進行了生物學重 復轉染實驗（n= 3)。用SAS8. 2軟件對結果進行統(tǒng)計分析，用t檢驗法進行顯著性檢驗： 其中，P< 0. 05表明存在顯著差異，P〈0. 01表明存在極顯著差異。結果如圖2顯示：轉染 后24h，sibMEN-1、sibMEN-1/2/3轉染組與對照組相比能極顯著降低MENlmRNA的表達量 (P〈0. 01)，干擾效率分別達到63%、75% ;轉染后48h，sibMEN-1、sibMEN-1/2/3轉染組同 樣能極顯著降低MENlmRNA的表達量（P〈0. 01)，干擾效率分別達到55%、50% ;轉染后72h， sibMEN-1轉染組與對照組相比依然能極顯著降低MENlmRNA的表達量（P〈0. 01)，干擾效率 為74%，sibMEN-1/2/3轉染組能顯著降低MENlmRNA的表達量（P〈0. 05)，干擾效率為62 %。 總體而言，對于牛MAC-T細胞，sibMEN-1/2/3 (混合形成一個siRNAspool)的干擾效率最 高，在轉染后24h干擾效率最佳，可達到75%。
[0048] 實施例4Westernblot檢測轉染細胞中牛MENl基因編碼蛋白表達水平
[0049] 將sibMEN-1、sibMEN-1/2/3分別轉染MAC-T細胞后24h、48h和72h分別提取細 胞總蛋白質。Western-Blot檢測牛MENl編碼蛋白menin的相對表達量，以牛0 -actin作 為內(nèi)參蛋白。鼠源0-actin抗體（AA128,碧云天）購自北京碧云天生物技術研究所，兔源 menin多克隆抗體（A300-105A)購自BETHYL，USA。HRP標記山羊抗鼠IgG(A0216)、山羊抗 兔IgG(A0208)都購自北京碧云天生物技術研究所。掃描膠片（彩色掃描儀，BenQSCANNER 5560)，并用ImageJ軟件分析目的條帶的灰度值，目的蛋白與內(nèi)參蛋白（0-actin)的灰度 值的比值，即為各處理組的蛋白相對表達量。
[0050] 結果如圖3和4所示，蛋白表達檢測顯示：轉染后24h，sibMEN-1、sibMEN-1/2/3 轉染組與對照組相比能極顯著降低Menin蛋白的相對表達量（P〈0. 01)，干擾效率分別達到 68%、71 % ;轉染后48h，sibMEN-1轉染組與對照組相比能極顯著降低Menin蛋白的表達量 (P〈0. 01)，干擾效率為64%，sibMEN-1/2/3轉染組的干擾效率為42%，與對照組之間沒有 差異；轉染后72h，sibMEN-1、sibMEN-1/2/3轉染組與對照組之間沒有差異?？傮w而言，對 于MAC-T細胞，轉染sibMEN-1/2/3 (混合形成一個siRNAspool) 24h后，menin蛋白的表達 效率最高發(fā)可達到71%。
[0051] 結果可知，經(jīng)qRT_PCR、Westernblot檢測，該發(fā)明中的3個siRNAs都可以有效干 擾牛MENl基因的mRNA表達，但三個siRNAs混合形成一個siRNAspool，即sibMEN-1/2/3 轉染細胞后24h的干擾效率最高最佳，sibMEN-1次之。
【主權項】
1. 一種抑制牛MENl基因表達的siRNAs，其特征在于：所述的siRNAs為小雙鏈RNA， 其正義鏈核苷酸序列為SEQ NO. 4、SEQ NO. 5、SEQ NO. 6所示；其反義鏈核苷酸序列為SEQ NO. 7、SEQ NO. 8 和 SEQ NO. 9 所示。2. 根據(jù)權利要求1所述的抑制牛MENl基因表達的siRNAs，其特征在于，所述三個 siRNAs雙鏈中： (1) sibMEN-1 :由正義鏈核苷酸序列SEQ NO. 4和反義鏈核苷酸序列SEQ NO. 7退火形 成； (2) sibMEN-2 :由正義鏈核苷酸序列SEQ NO. 5和反義鏈核苷酸序列SEQ NO. 8退火形 成； (3) sibMEN-3 :由正義鏈核苷酸序列SEQ NO. 6和反義鏈核苷酸序列SEQ NO. 9退火形 成。3. 權利要求1所述的siRNAs在抑制牛MENl基因表達中的應用。
【專利摘要】本發(fā)明涉及動物遺傳學和動物分子細胞生物學，提供了抑制牛MEN1基因表達的siRNAs，所述的siRNAs為小雙鏈RNA，包括三個siRNAs，其正義鏈核苷酸序列為SEQ？NO.4、SEQ？NO.5、SEQ？NO.6所示；其反義鏈核苷酸序列為SEQ？NO.7、SEQ？NO.8和SEQ？NO.9所示；本發(fā)明提供了含上述正反義鏈的抑制牛MEN1基因的siRNAs可以有效抑制牛MEN1基因表達，可為牛MEN1基因功能的研究提供有效技術工具，并可用于牛代謝疾病的相關研究。
【IPC分類】C12N15/113
【公開號】CN105087586
【申請?zhí)枴緾N201510566637
【發(fā)明人】師科榮, 劉學, 李洪輝, 王中華, 杜紅霞, 岳書儉, 徐忠金, 曹巧巧, 林雪彥, 侯秋玲, 閆振貴, 胡志勇, 王云
【申請人】山東農(nóng)業(yè)大學
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年9月8日