一種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動物病毒基因工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白 表達(dá)載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬2型圓環(huán)病毒（Porcinecircovirus，PCV-2)被認(rèn)為是豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜 合征（PMffS)，增生性壞死性肺炎（PNP)、豬皮膚與腎病綜合征（PDNS)、豬呼吸系統(tǒng)疾病綜合 征（PRDC)、繁殖障礙、先天性震顫及腸炎等疾病的主要病原，統(tǒng)稱豬2型圓環(huán)病毒相關(guān)疾 病，而且PCV-2感染引起免疫抑制，極易導(dǎo)致其它病原混合感染或繼發(fā)感染，是目前嚴(yán)重危 害養(yǎng)豬業(yè)的病原之一。在我國，目前幾乎100%豬場為豬2型圓環(huán)病毒陽性。
[0003] 目前，國內(nèi)外都有商品化的豬圓環(huán)病毒2型疫苗，主要分為3種。第1種是亞單位 疫苗，主要表達(dá)PCV-2的0RF2蛋白作為免疫原，再加上合適的疫苗佐劑配制疫苗；其代表性 的產(chǎn)品包括勃林格殷格翰的CircoFlex疫苗。第2種是嵌合病毒滅活疫苗，即用PCV-2的 0RF2基因置換PCV-I的0RF2基因，然后用構(gòu)建的嵌合病毒制備滅活疫苗；其代表性的產(chǎn)品 為富道公司的Suvaxyn疫苗。第3種是全病毒滅活疫苗，梅里亞公司出品的Circovace疫 苗和國產(chǎn)圓環(huán)疫苗均屬于此類。
[0004] 目前在國內(nèi)的市售疫苗主要為國產(chǎn)滅活疫苗與勃林格殷格翰的CircoFlex。而國 產(chǎn)疫苗由于為全病毒滅活疫苗，病毒增殖滴度低，生產(chǎn)成本高，導(dǎo)致不僅價格高，而且免疫 效果不理想。而勃林格殷格翰采用桿狀表達(dá)主要的免疫原性Cap蛋白，不僅抗原含量高，副 反應(yīng)小，但是價格昂貴。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白 表達(dá)載體，以便利用廉價的大腸桿菌高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒的Cap蛋白亞單位抗原，顯著降 低抗原生產(chǎn)成本，簡化生產(chǎn)工藝，為養(yǎng)豬業(yè)提供物美價廉的疫苗產(chǎn)品。
[0006] 為解決上述問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的表達(dá)載體是豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因經(jīng)過優(yōu)化 后得到的優(yōu)化密碼子克隆至pET_28a載體中所獲得的表達(dá)載體。
[0008] 進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的優(yōu)化密碼子的核苷酸序列為SEQIDNO. 1所示。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種圓環(huán)病毒2型Cap蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法， 通過該方法獲得一種能高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒的Cap蛋白亞單位抗原的蛋白表達(dá)載體。
[0010] -種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括以下步 驟：
[0011] 1)獲取豬圓環(huán)病毒2型0RF2序列；
[0012] 2)對0RF2序列的進(jìn)行密碼子優(yōu)化：根據(jù)大腸桿菌中密碼子的使用頻率，對0RF2 序列的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化密碼子；
[0013] 3)PCR擴(kuò)增：以上述優(yōu)化密碼子為模板使用疊加PCR方法進(jìn)行全基因擴(kuò)增；
[0014] 4)構(gòu)建表達(dá)載體：將pET_28a用NcoI與XhoI雙酶切，然后將步驟3)的擴(kuò)增產(chǎn) 物克隆至NcoI與XhoI位點(diǎn)之間，得到目的產(chǎn)物，目的產(chǎn)物經(jīng)NcoI與XhoI雙酶切鑒定， 表達(dá)載體構(gòu)建完成。
[0015] 進(jìn)一步的，本發(fā)明步驟2)所得到的優(yōu)化密碼子序列為SEQIDNO. 1所示。
[0016] 進(jìn)一步的，本發(fā)明步驟3)PCR擴(kuò)增中所用的引物如下：
[0017] 上游引物由 5' 端向 3' 端序列為：CATGCCATGGGCACCTACCCGCGCCGTCGIT;
[0018] 下游引物 5' 端向 3' 端序列為：GTGCTCGAGTTACGGGITCAGCGGCGGATCTITC。
[0019] 進(jìn)一步的，本發(fā)明步驟4)經(jīng)NcoI與XhoI雙酶切鑒定步驟為：回收目的產(chǎn)物的 目的條帶，連接后轉(zhuǎn)化DH5a，用卡那霉素LB平板篩選，挑取陽性菌落用含卡那霉素LB培養(yǎng) 液培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，用NcoI/XhoI雙酶切鑒定。
[0020] 本發(fā)明的第三個目的在于提供圓環(huán)病毒2型Cap蛋白表達(dá)載體用于檢測免疫答應(yīng) 效應(yīng)。
[0021] 本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的表達(dá)載體用于表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型Cap 蛋白。
[0022] 本發(fā)明的第四個目的在于提供利用本發(fā)明的表達(dá)載體表達(dá)豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋 白的方法，該方法包括以下步驟：
[0023] 1)誘導(dǎo)表達(dá)：將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌中，用卡那霉素LB平板篩選，獲得陽性菌 株，挑取陽性菌落接種含卡那霉素LB培養(yǎng)液，震蕩培養(yǎng)至少12h，然后經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)、震蕩培 養(yǎng)4h后將溫度降低至25~30°C，加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心收集菌體加入裂解液重懸菌體， 用高壓均質(zhì)機(jī)破碎菌體，離心收集上清，用SDS-PAGE鑒定表達(dá)載體表達(dá)情況；
[0024] 2)豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的純化，按照以下步驟進(jìn)行：
[0025] a)將高壓均質(zhì)機(jī)破碎后的菌體離心上清，使用50%飽和度硫酸銨進(jìn)行分級沉淀， 離心收獲沉淀；
[0026] b)用PBS緩沖液溶解，離心棄去沉淀；
[0027]c)上清加入5%曲拉通X-114,冰上混合后轉(zhuǎn)移至37°C的水浴保持30分鐘；
[0028] d)待溶液渾濁后，高速離心使溶液分層，小心轉(zhuǎn)移水相，棄曲拉通有機(jī)相；
[0029] e)重復(fù)步驟c)、d)直到內(nèi)毒素小于50EU/ml，SDS-PAGE確定豬圓環(huán)病毒2型Cap 蛋白濃度。
[0030] 本發(fā)明的第五個目的在于提供豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白在制備抗豬圓環(huán)病毒2型 Cap蛋白疫苗中的應(yīng)用。
[0031] 本發(fā)明還提供了一種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白疫苗，包括抗原和佐劑，所述抗原為 本發(fā)明所獲得的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白，豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白抗原和佐劑的體積比 為4 : 1，豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白抗原的濃度為30yg/mL-40iig/mL。
[0032] 相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明能夠構(gòu)建出高效表達(dá)豬2型圓環(huán) 病毒主要免疫原性蛋白Cap蛋白的原核表達(dá)載體，并通過利用大腸桿菌進(jìn)行高效表達(dá)出豬 2型圓環(huán)病毒Cap蛋白，顯著降低抗原生產(chǎn)成本，簡化生產(chǎn)工藝，為養(yǎng)豬業(yè)提供物美價廉的 疫苗產(chǎn)品。
[0033] 下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
【附圖說明】
[0034] 圖1為PCV-20RF2基因片段PCR擴(kuò)增電泳圖，其中M:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1 : PCV-20RF2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0035] 圖2為pShac3轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)后誘導(dǎo)表達(dá)，其中M:蛋白分子量 標(biāo)準(zhǔn)；1 :誘導(dǎo)后全菌；2 :誘導(dǎo)后裂解細(xì)胞上清；
[0036] 圖3為重組Cap蛋白純化前與純化后比較，其中Marker:DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。
【具體實(shí)施方式】
[0037] 本發(fā)明所述的豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的表達(dá)載體，該表達(dá)載體是豬圓環(huán)病毒2 型0RF2基因經(jīng)過優(yōu)化后得到的優(yōu)化密碼子克隆至pET-28a載體中所獲得的表達(dá)載體。
[0038] 進(jìn)一步的，本發(fā)明所述的優(yōu)化密碼子的核苷酸序列為SEQIDNO. 1所示。
[0039] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種圓環(huán)病毒2型Cap蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建方法， 通過該方法獲得一種能高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒的Cap蛋白亞單位抗原的蛋白表達(dá)載體。
[0040] -種豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，該構(gòu)建方法包括以下步 驟：
[0041] 1)獲取豬圓環(huán)病毒2型0RF2序列；
[0042] 2)對0RF2序列的進(jìn)行密碼子優(yōu)化：根據(jù)大腸桿菌中密碼子的使用頻率，對0RF2 序列的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，得到優(yōu)化密碼子；
[0043] 3)PCR擴(kuò)增：以上述優(yōu)化密碼子為模板使用疊加PCR方法進(jìn)行全基因擴(kuò)增；
[0044] 4)構(gòu)建表達(dá)載體：將pET_28a用NcoI與XhoI雙酶切，然后將步驟3)的擴(kuò)增產(chǎn) 物克隆至NcoI與XhoI位點(diǎn)之間，得到目的產(chǎn)物，目的產(chǎn)物經(jīng)NcoI與XhoI雙酶切鑒定， 表達(dá)載體構(gòu)建完成。
[0045] 進(jìn)一步的，本發(fā)明步驟2)所得到的優(yōu)化密碼子序列為SEQIDNO. 1所示。
[0046] 進(jìn)一步的，本發(fā)明步驟3)PCR擴(kuò)增中所用的引物如下：
[0047] 上游引物由 5' 端向 3' 端序列為：CATGCCATGGGCACCTACCCGCGCCGTCGIT;
[0048] 下游引物 5' 端向 3'