重組表達(dá)人呼吸道合胞病毒f1蛋白胞外區(qū)的方法及表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于病毒學(xué)和生物工程領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及重組表達(dá)人呼吸道合 胞病毒Fl蛋白胞外區(qū)的方法及表達(dá)系統(tǒng)。
【背景技術(shù)】
[0002] 人呼吸道合胞病毒能夠感染嬰兒、小孩與老人等免疫力低下群體；引起上呼吸道 感染，出現(xiàn)咳嗽、流涕與發(fā)燒等感冒樣癥狀，并且還能造成嬰幼兒的下呼吸道感染，引起細(xì) 支氣管炎、哮喘與肺炎等疾病，嚴(yán)重時(shí)危及生命。
[0003] 因?yàn)樵摬《灸軌蛘T導(dǎo)感染細(xì)胞形成合胞,故名為人呼吸道合胞病毒。F蛋白在感染 過(guò)程中分裂形成Fl與F2兩個(gè)功能性亞單位，輔助病毒感染細(xì)胞；同時(shí)F蛋白決定該病毒主 要的免疫原性。其中Fl蛋白起著主要作用，從分子量上占據(jù)了 80%的F蛋白，它包含有胞 內(nèi)區(qū)、胞膜區(qū)與胞外區(qū)，直接介導(dǎo)病毒與細(xì)胞的融合，胞外區(qū)包含了主要的F蛋白抗原決定 簇，主導(dǎo)F蛋白與該病毒的免疫原性。
[0004] 現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)于人呼吸道合胞病毒Fl蛋白的重組表達(dá)主要集中在原核系統(tǒng)表 達(dá)，但是原核表達(dá)系統(tǒng)的缺陷是易于產(chǎn)生包涵體，經(jīng)歷變復(fù)性步驟之后使得蛋白的三級(jí)結(jié) 構(gòu)產(chǎn)生破環(huán)。而應(yīng)用真核系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)的一般方法并不易于成功表達(dá)。因此，本領(lǐng)域有必 要研究開發(fā)有利于表達(dá)Fl蛋白（包含其抗原決定簇）的方法，從而為后續(xù)制備疫苗或抗病 毒制劑奠定基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供重組表達(dá)人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外區(qū)的方法及表達(dá) 系統(tǒng)。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種重組表達(dá)人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外區(qū)的方 法，包括：利用果蠅S2細(xì)胞作為表達(dá)宿主，表達(dá)人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外區(qū)；其中，所 述的人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外區(qū)的氨基酸序列如SEQIDN0:4所示。
[0007] 在一個(gè)優(yōu)選例中，利用果蠅S2細(xì)胞作為表達(dá)宿主表達(dá)人呼吸道合胞病毒Fl蛋白 胞外區(qū)的方法包括：
[0008] (1)提供表達(dá)載體，所述的表達(dá)載體中含有人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外區(qū)的表 達(dá)盒；
[0009] (2)將（1)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化果蠅S2細(xì)胞，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有所述表達(dá)載體的重組果蠅S2 細(xì)胞，從而表達(dá)人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外區(qū)。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)盒中包括SEQIDN0:3所示的核苷酸序列。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的表達(dá)載體是果蠅表達(dá)載體，如pMT質(zhì)粒，更具體地如pMT/ BIP/V5-His-A〇
[0012] 在另一優(yōu)選例中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化有所述表達(dá)載體的重組果蠅S2細(xì)胞包括：以大于 2XIO6細(xì)胞/ml的接種量將重組果蠅S2細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中，28 土rC培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá) 至IJIXIO7細(xì)胞/ml后，補(bǔ)加培養(yǎng)基；待細(xì)胞密度再次達(dá)到IXIO7細(xì)胞/ml后，以誘導(dǎo)劑CdCl2 誘導(dǎo)培養(yǎng)。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，誘導(dǎo)培養(yǎng)后還包括：收集細(xì)胞培養(yǎng)液，離心收集培養(yǎng)上清液，親 和層析純化。
[0014] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外區(qū)，其氨基酸序列 如SEQIDNO:4 所示。
[0015] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種多核苷酸，其編碼所述的人呼吸道合胞病毒Fl蛋 白胞外區(qū)。
[0016] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO: 3中第2-1132位所 /Jn〇
[0017] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，其包含所述的多核苷酸。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組果蠅S2細(xì)胞，其包含所述的表達(dá)載體，或其 基因組中整合有所述的多核苷酸。
[0019] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1、截短的hRSV-Fl-lcDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0021] 圖2、截短的hRSV-Fl-1基因與pMT/BIP/V5-His-A重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果。
[0022] 圖3、轉(zhuǎn)染截短的hRSV-Fl-1的S2細(xì)胞培養(yǎng)上清的western blot鑒定。
[0023] 圖4、轉(zhuǎn)染截短的hRSV-Fl-2的S2細(xì)胞培養(yǎng)上清的western blot鑒定。第1道 是Marker，第2道是轉(zhuǎn)染細(xì)胞1沒有誘導(dǎo)，第3道是轉(zhuǎn)染細(xì)胞1有誘導(dǎo)，第4道是轉(zhuǎn)染細(xì)胞 2沒有誘導(dǎo)，第5道是轉(zhuǎn)染細(xì)胞2有誘導(dǎo)。
[0024] 圖5、穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清液Western Blot分析結(jié)果。
[0025] 圖6、左圖：人截短的hRSV-Fl-1蛋白大量純化考馬斯亮藍(lán)結(jié)果（第1-2道是S2 表達(dá)其他蛋白上清的純化對(duì)照?qǐng)D，第3道是Markerl，第4道是截短的hRSV-Fl-1的純化對(duì) 照?qǐng)D，第5道是Marker2)。右圖；人截短的hRSV-Fl-1蛋白大量純化WesternBlot結(jié)果 (泳道3為Marker,泳道1、2為純化時(shí)往柱子加入洗脫緩沖液以后的第一管與第二管流出 液（各2ml)各條帶大小如圖標(biāo)示）。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 本發(fā)明揭示了一種截短型的人呼吸道合胞病毒Fl蛋白的真核表達(dá)方法，使用本 方法可以實(shí)現(xiàn)人呼吸道合胞病毒Fl蛋白的大規(guī)模生產(chǎn)和純化，為針對(duì)呼吸道合胞病毒的 疫苗、治療性抗體研究提供了研制基礎(chǔ)。
[0027] 如本文所用，所述的"截短型的人呼吸道合胞病毒Fl蛋白"、"人呼吸道合胞病毒 Fl蛋白胞外區(qū)"、"人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外區(qū)"、"hRSV-Fl-1"可互換使用，均指 具有SEQIDN0:4氨基酸序列的多肽。
[0028] 本發(fā)明提供了人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外區(qū)。鑒于現(xiàn)有技術(shù)中難以真核表達(dá) 人呼吸道合胞病毒Fl蛋白的狀況，本發(fā)明人進(jìn)行了深入的研究，制備了多種人呼吸道合胞 病毒Fl蛋白的截短體的編碼基因，本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，編碼SEQIDN0:4多肽的序列能 夠?qū)崿F(xiàn)在果蠅S2細(xì)胞中成功表達(dá)，而比該序列更長(zhǎng)的截短體基因則無(wú)法成功表達(dá)。
[0029] 因此，本發(fā)明提供了編碼所述的人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外區(qū)的分離的 核酸，也可以是其互補(bǔ)鏈。編碼本發(fā)明人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外區(qū)的DNA序列， 可以全序列人工合成，也可用PCR擴(kuò)增的方法獲得。
[0030]在獲得了編碼帶有人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外區(qū)的DNA序列之后，將其連 入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入果蠅S2細(xì)胞。最后通過(guò)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞，通過(guò)分離純化得到 帶有人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外區(qū)。
[0031] 因此，本發(fā)明還提供了包含編碼所述帶有人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外區(qū) 的核酸分子的載體。所述的載體還可包含與所述核酸分子的序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序 列，以便于所述帶有人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外區(qū)的表達(dá)。"操作性相連"或"可操 作地連于"指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其它部 分的活性。例如，如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。
[0032]在本發(fā)明中，任何合適的載體都可以使用，比如一些用于真核表達(dá)的載體，可參考 如Pouwels等，克隆載體：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（Elsevier最新版）中所描述的?？蛇x用本領(lǐng)域已知 的各種載體如市售的載體。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述的載體為適用于轉(zhuǎn)化果蠅S2 細(xì)胞的載體。
[0033]此外，含有編碼所述帶有人呼吸道合胞病毒Fl蛋白主要胞外區(qū)的核酸序列的重 組細(xì)胞也包括在本發(fā)明中。在本發(fā)明中，所述的"重組細(xì)胞"是果蠅S2細(xì)胞。用重組DNA轉(zhuǎn) 化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。
[0034]本發(fā)明提供了重組表達(dá)人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外區(qū)的方法，所述方法包括： 利用果蠅S2細(xì)胞作為表達(dá)宿主，表達(dá)人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外區(qū)。
[0035]對(duì)比諸如CHO等哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，本發(fā)明提供的人呼吸道合胞病毒Fl蛋白 胞外區(qū)的真核表達(dá)系統(tǒng)可以方便的用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，具有產(chǎn)量高、過(guò)程監(jiān)控容易、質(zhì) 量控制容易與成本低廉等優(yōu)點(diǎn)。
[0036] 對(duì)比諸如E.coli等原核表達(dá)系統(tǒng)，本發(fā)明提供的人呼吸道合胞病毒Fl蛋白胞外 區(qū)的真核表達(dá)系統(tǒng)得到的目的蛋白由于具有真核表達(dá)系統(tǒng)特有的糖基化修飾，與人呼吸道 合胞病毒感染后子代病毒攜帶的Fl蛋白擁有類似的天然構(gòu)象，具有更好的生物學(xué)活性，能 夠?yàn)楹罄m(xù)試驗(yàn)研究提供有力的支撐。
[0037] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0038] 實(shí)施例1、人呼吸道合胞病毒截短Fl蛋白cDNA的PCR擴(kuò)增
[0039] 1)根據(jù)NCBIGenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)提供的人呼吸道合胞病毒（hRSV)A2毒株基因組 的基本信息：HumanrespiratorysyncytialvirusstrainA/ffI/629-3/06-07,Sequence ID:gbIJF920069.I，并獲取其DNA序列。
[0040] 2)從步驟I)獲得的DNA序列中截取所需要的Fl基因截短片段（相對(duì)于 GenBank:JX198138. 1提供的全長(zhǎng)Fl基因序列，截短片段位于全長(zhǎng)核苷酸序列序列的第 1946-3077位），位于全長(zhǎng)氨基酸序列的第153-529位），獲得相對(duì)應(yīng)DNA序列；另外根據(jù)果 蠅S2 表達(dá)系統(tǒng)（DrosophialExpressionSystem)使用的表達(dá)載體pMT/BIP/V5-His_A(購(gòu) 自英駿公司）的多克隆位點(diǎn)的相應(yīng)性質(zhì)，選擇合適的酶切位點(diǎn)；再以獲取的序列為模板，加 上選取的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)用于PCR的上下游引物，引物序列如下（注：下劃線分別表示EcoR I和XholI酶切位點(diǎn)）：
[0041]if向引物：5' -CGGAATTCTGCTGTATCTAAGGTCCTGC-3'(SEQIDNO:5)；
[0042] 反向引物：5' -CGCTCGAGAGTAGTTATCATGATATTTGTGGTG-3'(SEQIDN0:6)。
[0043] 3)以從ATCC購(gòu)得的人呼吸道合胞病毒標(biāo)準(zhǔn)株A2為模板，因?yàn)閔RSV為逆轉(zhuǎn)錄病 毒，借用逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA;再利用Phusion高保真酶，結(jié)合已經(jīng)設(shè)計(jì)的引物，以PCR方法獲 取截短的hRSV-Fl-1基因片段，具體PCR體系配比與反應(yīng)程序如下（參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指 南》方法使用上述特異性引物對(duì)截短的hRSV-Fl-1進(jìn)行擴(kuò)增）：
[0044]i.PCR體系總體積：50U1
[0049] 4)PCR產(chǎn)物的檢測(cè)采用瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行，所用凝膠為1%瓊脂糖凝膠，分子 量標(biāo)記為購(gòu)自TaKaRa公司的DL2,OOODNAMarker(D501A)，電泳結(jié)果如圖1所示。
[0050] 5)再通過(guò)膠回收的方法回收提取目的基因片段，即截短的hRSV-Fl-1回收產(chǎn)物。 截短的hRSV-Fl-1基因具有SEQIDN0:3所示序列，編碼SEQIDN0:4所示的蛋白。
[0051] 采用如前所述的方法，申請(qǐng)人還制備了截短的hRSV-Fl-2基因產(chǎn)物，該基因具有 SEQIDNO: 1所示序列（