使用外周注射aav載體向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行廣泛基因投送的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】使用外周注射AAV載體向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行廣泛基因投送
[0001]本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)日2008年10月3日、國(guó)際申請(qǐng)?zhí)朠CT/EP2008/063297于2010年5月24日進(jìn)入中國(guó)國(guó)家階段、申請(qǐng)?zhí)?00880117413.0、發(fā)明名稱(chēng)“使用外周注射AAV載體向運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行廣泛基因投送”的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及將基因投送到哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的組合物和方法。本發(fā)明還涉及通過(guò)治療性基因的表達(dá)，在哺乳動(dòng)物中治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病癥的方法。本發(fā)明基于未預(yù)料到的發(fā)現(xiàn)，即AAV載體的外周注射導(dǎo)致繞過(guò)血腦屏障，并大量感染運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的其他細(xì)胞。本發(fā)明可用于任何哺乳動(dòng)物，包括人類(lèi)對(duì)象。
【背景技術(shù)】
[0003]運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(MN)疾病，例如脊髓性肌萎縮(SMA)、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)或肯尼迪(Kennedy’ s)病，是神經(jīng)變性病癥，其特征在于脊髓、腦干和/或皮層運(yùn)動(dòng)中MNs的選擇性變性(Monari 2005 ;Pasinelli 和 Brown 2006) ; (MacLean, Warne 等，1996)。這些疾病沒(méi)有治療方法，主要是因?yàn)榻?jīng)全身注射進(jìn)行藥物投送，受到存在“血腦屏障”(BBB)的阻礙。這種解剖學(xué)和生理學(xué)屏障由中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密聯(lián)結(jié)形成，防止分子在循環(huán)與CNS之間的便捷分子通道(Scherrmann 2002)。MN的另一種供應(yīng)方法，將重組蛋白直接注射到CNS實(shí)質(zhì)中，也是困難的，這是由于外科程序的侵入性妨礙了潛在的臨床應(yīng)用。
[0004]經(jīng)典藥物學(xué)的失敗，導(dǎo)致科學(xué)界開(kāi)發(fā)了具體來(lái)說(shuō)基于使用病毒載體的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的新治療策略。但是，常規(guī)的病毒載體一般不能透過(guò)BBB，第一種提出的基因轉(zhuǎn)移策略包括將載體鞘內(nèi)投送或直接注射到脊髓實(shí)質(zhì)中(Davidson, PNAS 2000) (Azzouz, Hottinger等，2000)。但是，這些侵入性方法不能產(chǎn)生有效的廣泛CNS轉(zhuǎn)導(dǎo)。也使用了將病毒載體注射到腦室中，目的在于轉(zhuǎn)導(dǎo)脈絡(luò)叢和室管膜的上皮細(xì)胞，介導(dǎo)腦脊液(CSF)中治療性蛋白的分泌，并進(jìn)一步擴(kuò)散通過(guò)CNS實(shí)質(zhì)(Passini和Wolfe 2001)。但是，重組蛋白向整個(gè)神經(jīng)組織的擴(kuò)散遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠最好，并且同樣，與外科程序相關(guān)的潛在風(fēng)險(xiǎn)也是這種方法臨床應(yīng)用的障礙。
[0005]通過(guò)肌肉內(nèi)(1.m.)注射，利用病毒載體向麗的逆向軸突運(yùn)輸，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了替代的非侵入性策略?；蜉d體例如腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)或帶有狂犬病G糖蛋白的馬貧血病毒假型(EIAV)，的確在肌肉內(nèi)注射后經(jīng)歷了沿著MN軸突的逆向運(yùn)輸，并在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中成功地用于轉(zhuǎn)導(dǎo)下位MN(Finiels等，1995 ；Kaspar等，2003 ；Azzouz等，2004)。然而，這種方法的臨床價(jià)值仍然是成問(wèn)題的，具體來(lái)說(shuō)是由于在影響患者的大部分運(yùn)動(dòng)單位的病理中，為了定向MN，需要大量的注射位點(diǎn)和病毒粒子。
[0006]為了抵消這些困難，我們?cè)谛∈笾性囼?yàn)了新的AAV血清型和基因組在肌肉內(nèi)a.m.)、靜脈內(nèi)α.ν.)和腹膜內(nèi)α.ρ.)投送后的麗轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。具體來(lái)說(shuō)，我們比較了血清型I和9的重組單鏈和自身互補(bǔ)型AAV載體(分別為ssAAV和scAAV)在小鼠中介導(dǎo)CNS轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。
[0007]我們的主要結(jié)果證明，在1.v.投送到小鼠后，重組AAV載體(例如scAAV9)特別有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)脊髓MNs。此外，我們顯示了這種方法在大動(dòng)物模型中的可行性，該動(dòng)物模型是類(lèi)似于人類(lèi)III型SMA、與LIXl基因的缺失相關(guān)的常染色體隱性SMA的家貓模型(Fyfe等，2006)。我們的方法也允許轉(zhuǎn)導(dǎo)其他CNS細(xì)胞，包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，海馬和韁核中的神經(jīng)元，以及星形細(xì)胞。因此，本發(fā)明第一次顯示了在小鼠中，有可能在單次1.V.注射后將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)移到麗S，實(shí)現(xiàn)了向脊髓和/或其他神經(jīng)細(xì)胞的廣泛基因投送，因此提供了治療麗疾病的新途徑。
[0008]發(fā)曰月概沐
[0009]本發(fā)明涉及使用重組AAV載體向CNS投送治療性產(chǎn)物的新的組合物和方法。更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及通過(guò)AAV載體的外周給藥，用于將基因投送到哺乳動(dòng)物對(duì)象的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的組合物和方法。
[0010]更具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的目的涉及使用含有目標(biāo)基因(例如編碼治療性或診斷性產(chǎn)物)的AAV載體，來(lái)制造通過(guò)所述AAV載體向所述對(duì)象進(jìn)行外周給藥而向中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞、特別是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞投送基因的藥物。
[0011]本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及使用含有目標(biāo)基因(例如編碼治療性或診斷性產(chǎn)物)的AAV載體，來(lái)制造通過(guò)所述AAV載體向所述對(duì)象的外周給藥，從而向脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元投送基因的藥物。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)在于在哺乳動(dòng)物中向中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞、特別是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞投送基因的方法，方法包括通過(guò)外周途徑向哺乳動(dòng)物給藥含有所述基因的AV載體，所述給藥使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞、特別是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞被所述AAV載體感染，從而向中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞、特別是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞投送所述基因。
[0013]本發(fā)明的目的還涉及使用含有治療性基因的AAV載體，來(lái)制造在對(duì)象中治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病癥的藥物，其中所述AAV載體通過(guò)向所述對(duì)象外周注射來(lái)進(jìn)行給藥，所述給藥引起(脊髓)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的感染和基因在(脊髓)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的表達(dá)。
[0014]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)涉及使用AAV載體，來(lái)制造通過(guò)所述載體的外周注射在對(duì)象的(脊髓)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中產(chǎn)生治療性蛋白或RNA的藥物。
[0015]本發(fā)明還涉及使用AAV載體，通過(guò)跨過(guò)血腦屏障，向中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞、特別是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞投送基因。
[0016]本發(fā)明還涉及在哺乳動(dòng)物對(duì)象中跨過(guò)血腦屏障的基因治療方法，方法包括向?qū)ο笸庵芙o藥AAV載體。
[0017]本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是在哺乳動(dòng)物對(duì)象中，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞、特別是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行遺傳修飾的方法，方法包括向?qū)ο笸庵芙o藥AAV載體。
[0018]本發(fā)明還涉及使用AAV載體，來(lái)制造通過(guò)AAV載體的外周給藥向脊髓投送基因的藥物。
[0019]本發(fā)明還涉及向?qū)ο蟮募顾柽M(jìn)行基因投送的方法，方法包括向?qū)ο笸庵芙o藥含有所述基因的AAV載體。
【附圖說(shuō)明】
[0020]圖1、在肌肉內(nèi)注射AAV后向新生小鼠肌肉和CNS進(jìn)行廣泛基因投送(藍(lán)色:mSEAP組織化學(xué)染色)。在注射SS-或scAAVl或AAV9后3天(PM)或7天(PN8)時(shí)(a)腓腸肌、(b)腦(第三腦室)和(c)脊髓的代表性橫向切片。
[0021]N1:未注射；PM，出生后第4天；PN8，出生后第8天；ss，單鏈；sc:自身互補(bǔ)。比例尺(b, c) 100 μ mD
[0022]圖2、在腹膜內(nèi)注射AAV后向新生小鼠肌肉和CNS進(jìn)行廣泛基因投送(藍(lán)色:mSEAP組織化學(xué)染色)。(a)橫膈肌，(b)第三腦室(箭頭:表達(dá)mSEAP的脈絡(luò)叢細(xì)胞；箭頭的頭:室管膜細(xì)胞)和(c)CNS實(shí)質(zhì)(箭頭:神經(jīng)元細(xì)胞)的代表性組織切片。
[0023]N1:未注射；PM，出生后第4天；PN8，出生后第8天；ss，單鏈；sc:自身互補(bǔ)。比例尺(a，b，c) 100 μ m ； (d) 40 μ m。
[0024]圖3、腹膜內(nèi)投送自身互補(bǔ)型AAV9-GFP在新生小鼠中介導(dǎo)了 CNS轉(zhuǎn)導(dǎo)。投送AAV后7天，對(duì)代表性的腦和脊髓橫向切片進(jìn)行GFP免疫組織化學(xué)處理。在(a)脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞，(b)具有神經(jīng)元(箭頭的頭和上方框)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(箭頭和下方框)形態(tài)的海馬細(xì)胞，(C)內(nèi)嗅皮層細(xì)胞(箭頭指示具有典型神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞)，(d，e)脊髓的細(xì)胞(箭頭指示具有運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元形態(tài)的GFP標(biāo)記的細(xì)胞)和(f)頸部脊髓中的感覺(jué)纖維中，檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。比例尺40 μ m。
[0025]圖4、自身互補(bǔ)型AAV9載體的肌肉內(nèi)投送允許在新生小鼠中轉(zhuǎn)導(dǎo)CNS細(xì)胞。注射AAV后7天，對(duì)腦和脊髓組織學(xué)切片進(jìn)行GFP免疫組織化學(xué)處理。在(a)脈絡(luò)叢上皮細(xì)胞(箭頭)和室管膜上皮細(xì)胞(箭頭的頭)，(b，c)中隔的神經(jīng)細(xì)胞和(d，e)內(nèi)嗅皮層的神經(jīng)細(xì)胞，以及(f)頸部脊髓中錐體交叉水平處的皮質(zhì)脊髓束(箭頭)中，檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。比例尺20 μ m。
[0026]圖5、靜脈內(nèi)投送自身互補(bǔ)型AAV9載體，在新生小鼠的CNS中介導(dǎo)了 GFP表達(dá)。在AAV注射后7天，GFP免疫染色處理的腦和脊髓組織學(xué)切片的代表性顯微照片。在(a)脈絡(luò)叢(箭頭)和室管膜(箭頭的頭)的上皮細(xì)胞，(C)腦血管，(d，f)具有神經(jīng)元(箭頭)和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(箭頭的頭)形態(tài)的海馬細(xì)胞，(g)內(nèi)嗅皮層的神經(jīng)元樣細(xì)胞中，檢測(cè)到GFP陽(yáng)性細(xì)胞。在整個(gè)脊髓中，在(h)頸部、(i)胸部和(j)腰部水平上，許多運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣的細(xì)胞體(箭頭)和纖維(箭頭的頭)被有效轉(zhuǎn)導(dǎo)。在未注射的小鼠的CNS中沒(méi)有觀察到染色，如來(lái)自(b)第三腦室或(e)海馬或(k-m)脊髓的代表性切片所顯示。比例尺(a，b)100ym，(c, d, f) 40 μ m，(e, g) 100 μ m，(h_m) 20 μ m。
[0027]圖6、表達(dá)GFP的單鏈AAV9載體在新生小鼠的CNS中介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。在1.V.注射SSkm后3周，GFP免疫組織化學(xué)處理的新生小鼠的腦和脊髓切片的代表性顯微照片。(a)脈絡(luò)叢(星號(hào))，海馬(箭頭的頭和框)和韁核(箭頭)，(b)正中隆起和(c-e)腹側(cè)脊髓中運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞中的GFP陽(yáng)性細(xì)胞。比例尺組b:100 μ m ;c，d, e:20 μ m。
[0028]圖7、重組AAV9載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在成年小鼠CNS中的表達(dá)。在靜脈內(nèi)投送3xlOn (b)或 IxlO12 (c-h)個(gè)表達(dá) mSEAP 的 scAAV9 (a, c)、ssAAV9 (b)、scAAV I (d)和 ssAAVl (e)的載體基因組后4周，來(lái)自成年C57bl6小鼠的代表性冠狀腦切片；比例尺組g，h, j:100 μ m ;組 i, k, 1:20 μ m。
[0029]圖8、靜脈內(nèi)注射的重組AAV9載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因在成年小鼠脊髓中的表達(dá)。在靜脈內(nèi)投送IxlO12個(gè)表達(dá)mSEAP的ssAAV9 (a, b)、scAAV9 (c, g)載體基因組后4周，來(lái)自成年C57bl6小鼠的代表性脊髓橫向切片。
[0030]比例尺(a，b，e):40 μm，框:20 μm ; (c, d):100 μπι ； (f):50 μm ； (g):20 μmD
[0031]圖9、在LIX-1貓中靜脈內(nèi)注射AAV9-GFP介導(dǎo)了轉(zhuǎn)基因在整個(gè)脊髓中的表達(dá)。在將表達(dá)GFP的scAAV9注射到頸靜脈中以后10天，使用激光掃描共聚焦顯微術(shù)(圖9a，c)或GFP免疫組織化學(xué)處理(圖9b，d)，觀察了來(lái)自2日齡LI