一種酵母生產(chǎn)手性氯苯基氯乙醇的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于制藥工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到產(chǎn)朊假絲酵母細(xì)胞生物催化制備手性 醫(yī)藥中間體（S)-2, 3' -二氯基苯乙醇的技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 手性（S)-2, 3' -二氯基苯乙醇是合成手性藥物、精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)藥品和其他特殊 材料的重要中間體。生物催化不對稱反應(yīng)具有環(huán)境友好、條件溫和、選擇性高等優(yōu)點，作為 綠色高效制備手性化合物的優(yōu)先途徑，被越來越多地應(yīng)用于生產(chǎn)一些高附加值的手性化 合物。生物催化制備手性（S)-2, 3' -二氯基苯乙醇具有很好的應(yīng)用前景。
[0003] 生物催化具有催化效率高、選擇性強、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點，是可持續(xù) 發(fā)展過程中替代和拓展傳統(tǒng)有機化學(xué)合成的重要方法。其中手性拆分和不對稱合成是生物 催化最具吸引力的應(yīng)用領(lǐng)域。在作為生物催化劑的六大類酶中，水解酶能夠催化動力學(xué)拆 分外消旋體得到手性產(chǎn)品，在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。近幾年來，氧化還原 酶在工業(yè)上的應(yīng)用得到了迅速增長。目前，采用水解酶動力學(xué)拆分法、生物還原法和生物 氧化法工業(yè)制備光學(xué)活性手性化合物的比例為4:2:1。
[0004] 生物還原法相對于動力學(xué)拆分法而言，最大的優(yōu)勢在于理論收率可達100%，原子 經(jīng)濟性好。然而生物還原反應(yīng)需要輔酶或輔因子的參與，一定程度上限制了其應(yīng)用。由于 輔酶依賴性的緣故，生物還原反應(yīng)中多釆用整細(xì)胞作為催化劑，實現(xiàn)體內(nèi)輔酶循環(huán)再生的 同時免去了酶的分離純化步驟。
[0005] (S)-2,3'_二氯基苯乙醇是合成手性藥物、精細(xì)化學(xué)品、農(nóng)藥品的重要手性砌塊，。 現(xiàn)有的方法普遍存在轉(zhuǎn)化率低、反應(yīng)時間長、需要添加昂貴輔酶、成本高等嚴(yán)重缺陷，難于 進行工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明將采用生物細(xì)胞催化制備（S)-2,3' -二氯基苯乙醇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明采用產(chǎn)朊假絲酵母細(xì)胞催化制備（S)-2, 3' -二氯基苯乙醇，反應(yīng)式如下：
底物2-3'-二氯基苯乙酮（1)經(jīng)產(chǎn)朊假絲酵母催化反應(yīng)，得到產(chǎn)物（S)_2,3'_二氯 基苯乙醇（2)。有多種微生物可以催化此反應(yīng)，經(jīng)過大量實驗篩選，最終確定采用產(chǎn)朊假絲 酵母作為催化劑，因為其催化反應(yīng)的效果最好，反應(yīng)收率、對映體過量率（ee%)均很高。
[0007] 許多產(chǎn)朊假絲酵母都可以進行生物催化此反應(yīng)，然而，其效果不同，相差很大，經(jīng) 實驗，本發(fā)明選用產(chǎn)朊假絲酵母菌株為ATCC9226，其催化反應(yīng)效果最佳。
[0008] 由于絕大多數(shù)氧化還原酶是輔酶NAD(P)H依賴型，而細(xì)胞本身所含有的輔酶量 可能較少，因此，進行氧化還原反應(yīng)時，為促進輔酶再生，提高反應(yīng)效率，在反應(yīng)體系中 還添加輔助底物構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系。常用的輔助底物種類較多，不同細(xì)胞所需的輔助底物不同， 效果差別很大，采用幾種輔助底物組合，可以取得較好效果，需進行大量實驗才能確定最佳 的輔助底物。本發(fā)明經(jīng)過大量實驗確定的輔助底物為：葡萄糖33-36g/L、木糖15-18g/L、異 丙醇7-9%V/V(體積濃度）。
[0009] 由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。
[0010] 培養(yǎng)介質(zhì)： 1、種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH為 6. 6;配制固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0011] 2、培養(yǎng)液成份：葡萄糖 20-22g/L，麥芽浸膏 23-25g/L，（NH4)2SO4 4. 8-5.3g/L， KH2PO4 9-11g/L，MgSO4. 7H20 0? 3-0. 4g/L，CaCl2 0? 35-0. 4g/L,硫酸銨 0? 2-0. 25g/L，硫 酸鎂 0.3-0. 4g/L，pH為 6. 6。
[0012] 2、固體培養(yǎng)基成份：在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。
[0013] 酵母細(xì)胞制備。產(chǎn)朊假絲酵母經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液；發(fā)酵罐加入 培養(yǎng)液，裝料系數(shù)為〇. 6-0. 7,121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至24-25°C，將產(chǎn)朊假絲酵母種 子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為6-6. 5%，通氣比為I. 7-1. 8VAV分鐘)，24-25°C培養(yǎng)44-46 小時，用過濾式離心機離心得到濕酵母細(xì)胞，用作生物催化反應(yīng)催化劑。
[0014] 生物催化轉(zhuǎn)化 底部通氣攪拌反應(yīng)罐中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6. 6,加入底物2-3' -二氯基苯乙 酮，使底物濃度為80-90g/L。其他成份：麥芽浸膏22-26g，直鏈的10碳醇聚氧乙烯醚為 17-18g/L，葡萄糖33-36g/L、木糖15-18g/L、異丙醇7-9%V/V(體積濃度），121°C高壓滅菌 30分鐘；冷卻至24-25°C時，加入濕酵母細(xì)胞使?jié)舛葹?4-60g/L，通氣比為0. 15-0. 16V/(V 分鐘)，即每分鐘通氣量為0. 15-0. 16倍反應(yīng)液體積，進行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時間為65-70 小時；反應(yīng)結(jié)束后，濾出細(xì)胞，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物（S)-2， 3' -二氯基苯乙醇，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率98-99%，產(chǎn)品收率96-97%，對映體過量率98. 5-99%。
[0015] 本發(fā)明所開展工作包括菌株選擇、催化反應(yīng)條件優(yōu)化(反應(yīng)溫度、通氣量、pH)、反 應(yīng)介質(zhì)選擇和濃度優(yōu)化，包括底物濃度、麥芽浸膏含量、輔助底物組合、表面活性劑種類及 濃度等。
[0016] 實施例1 種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，pH為6. 6; 配制固體培養(yǎng)基時添加15g/L的瓊脂粉。
[0017] 培養(yǎng)液成份為：葡萄糖20g/L，麥芽浸膏23g/L，木糖6g/L，（NH4)2SO4 4. 8g/L， KH2PO4 9g/L，MgSO4. 7H20 0? 3g/L，CaCl2 0? 35g/L，硫酸銨 0? 2g/L，硫酸鎂 0? 3g/L，pH為6. 6〇
[0018] 濕酵母細(xì)胞制備過程如下：產(chǎn)朊假絲酵母ATCC9226經(jīng)斜面、搖瓶培養(yǎng)，得到種子 液。IOL發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，121°C高壓滅菌30分鐘，冷卻至24-25°C，將產(chǎn)朊假絲酵母種 子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為6%，通氣比為I. 7VAV分鐘），24°C培養(yǎng)46小時，用過濾式 離心機離心得到濕酵母細(xì)胞，用作生物催化反應(yīng)催化劑。
[0019] 生物催化轉(zhuǎn)化：0. 5L底部通氣攪拌反應(yīng)器中加入磷酸鹽緩沖液，pH為6. 6,加入 底物2-3'-二氯基苯乙酮，使?jié)舛葹?0g/L，麥芽浸膏22g，直鏈的10碳醇聚氧乙烯醚為 17g/L，葡萄糖36g/L、木糖15g/L、異丙醇7%V/V(體積濃度），121°C高壓滅菌30分鐘；冷卻 至24-25°C時，加入濕酵母細(xì)胞使?jié)舛葹?4g/L，通氣比為0. 15V/(V分鐘)，進行生物催化反 應(yīng)，反應(yīng)時間為70小時；反應(yīng)結(jié)束后，濾出細(xì)胞，用乙酸乙酯萃取反應(yīng)液，蒸出乙酸乙酯，得 到產(chǎn)物（S) -2, 3'-二氯基苯乙醇，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率99%，產(chǎn)品收率97%，對映體過量率98. 5%。
[0020] 實施例2 種子培養(yǎng)基成份為：酵母提取物10g/L，葡萄糖20g/L，蛋白胨20