一種利用亞銨法紙漿為原料制備微生物油脂的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種以亞銨法預(yù)處理天然木質(zhì)纖維素獲 得的紙漿為原料，通過(guò)產(chǎn)油微生物發(fā)酵制備微生物油脂的方法。本發(fā)明可以更有效地利用 天然木質(zhì)纖維素材料生產(chǎn)微生物油脂，降低微生物油脂的生產(chǎn)成本投入，便于生產(chǎn)放大。
【背景技術(shù)】
[0002] -些微生物可在胞內(nèi)積累超過(guò)其細(xì)胞干重20%的油脂，主要成分為甘油三酯。其 油脂脂肪酸組成和植物油類似，主要為C16和C18的脂肪酸。由于微生物油脂的生產(chǎn)不受時(shí) 間、季節(jié)、地點(diǎn)以及氣候變化的影響，可以實(shí)現(xiàn)油脂規(guī)?；B續(xù)生產(chǎn)。微生物油脂生產(chǎn)技術(shù) 可為生物柴油和油脂工業(yè)提供新原料，具有重要應(yīng)用前景。
[0003] 生物質(zhì)是地球上第四大能源，并且是唯一可再生能源。木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)主要 由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素三大部分構(gòu)成。其中纖維素含量40-50%，半纖維素25-35%， 木質(zhì)素15-20%。木質(zhì)纖維素原料主要包括農(nóng)業(yè)和林業(yè)廢棄物。由于其來(lái)源廣泛，價(jià)格低 廉。因此，利用木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)微生物油脂，不僅能夠降低油脂成本，還可以廢物利用， 改善環(huán)境問(wèn)題。在植物組織中木質(zhì)素與半纖維素以共價(jià)鍵形式結(jié)合，并將纖維素分子包埋 其中，形成一種堅(jiān)固的天然屏障，使一般微生物很難進(jìn)入使其降解。因此，需要一些特殊的 方法破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)，從而對(duì)木質(zhì)纖維素進(jìn)行利用。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)對(duì)木質(zhì)纖維素原料生產(chǎn)微生物油脂進(jìn)行了廣泛的研究。離子 液體溶解木質(zhì)纖維素是近年發(fā)展起來(lái)的一種新的預(yù)處理方法，它能夠有效的破壞木質(zhì) 纖維素結(jié)構(gòu)，并脫除木質(zhì)素，顯著地提高酶解效率。使用離子液體預(yù)處理木質(zhì)纖維素， 進(jìn)而進(jìn)行油脂發(fā)酵已有文獻(xiàn)報(bào)道（Xieetal.Enzymatichydrolysatesofcornstover pretreatedbyaN-methylpyrrolidone-ionicliquidsolutionformicrobiallipid production.Greenchemistry. 2012, 14, 1202-1210)。但離子液體在使用中仍然存在一 些問(wèn)題：離子液體成本高，重復(fù)使用效率低，粘度大不利于放大。稀酸預(yù)處理是木質(zhì)纖維 素預(yù)處理中使用較為廣泛的方法。稀酸能夠破壞木質(zhì)纖維素中半纖維素的結(jié)構(gòu)，從而利 于后續(xù)的酉每水角軍（Runetal.Co-HydrolysisofLignocellulosicBiomassforMicrobial LipidAccumulation.Biotechnologyandbioengineering. 2013, 110, 1039-1049) 〇 稀酸 預(yù)處理能夠有效的破壞半纖維素的結(jié)構(gòu)，但是會(huì)產(chǎn)生糠醛、羥甲基糠醛、乙酸等副產(chǎn)物， 影響后續(xù)的油脂發(fā)酵（Huangetal.Biologicalremovalofinhibitorsleadstothe improvedlipidproductioninthelipidfermentationofcornstoverhydrolysateby Trichosporoncutaneum.BioresourceTechnology. 2011，102, 9705-9709 ;馮沖等.發(fā)酵性 絲孢酵母產(chǎn)油脂中纖維質(zhì)糖化液脫毒工藝對(duì)比及優(yōu)化研究.北京化工大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué) 版）.2011，38, 87-91)，增加油脂發(fā)酵成本。此外，還有氣爆預(yù)處理（陳尚妍等.蒸汽爆破預(yù) 處理對(duì)玉米秸稈化學(xué)組成及纖維結(jié)構(gòu)特性的影響.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè).2009, 29, 33-38)、堿 予頁(yè)處理（Wangetal.Fastandefficientnanoshearhybridalkalinepretreatmentofcorn stoverforbiofuelandmaterialsproduction.BiomassandBioenergy. 2013, 51，35-42)、 生物予頁(yè)處理(Yuetal.Theeffectofbiologicalpretreatmentwiththeselective white-rotfungusEchinodontiumtaxodiionenzymatichydrolysisofsoftwoodsand hardwoods.Bioresourcetechnology. 2009, 100, 5170-5175)、氨爆預(yù)處理（Lauetal.The impactsofpretreatmentonthefermentabilityofpretreatedlignocellulosic biomass:acomparativeevaluationbetweenammoniafiberexpansionanddiluteacid pretreatment.Biotechnologyforbiofuel. 2009, 2, 1-11)等預(yù)處理方法。雖然這些方法 能夠有效的破壞木質(zhì)纖維素結(jié)構(gòu)，但是因?yàn)檫^(guò)程復(fù)雜、成本高、副產(chǎn)物多等原因，將會(huì)增加 油脂生產(chǎn)過(guò)程的復(fù)雜性和資本的投入，從而推高微生物油脂的生產(chǎn)成本，且不利于微生物 油脂發(fā)酵過(guò)程放大和規(guī)?；a(chǎn)。
[0005] 制漿是造紙工藝的重要環(huán)節(jié)，是以植物纖維為原料，經(jīng)不同加工方法制得的纖維 狀物質(zhì)。工藝流程包括植物纖維原料粉碎、蒸煮、洗滌、篩選、漂白、凈化、烘干、紙漿。目前， 由于電子產(chǎn)品的普及對(duì)紙品市場(chǎng)產(chǎn)生巨大的沖擊，導(dǎo)致紙的供應(yīng)大于需求，而且一些新興 制漿造紙的成本較低，進(jìn)而導(dǎo)致紙漿銷量和價(jià)格下降，造成了造紙企業(yè)利潤(rùn)減少、虧損增加 (MahdiMachanietal.Amathematically-basedframeworkforevaluatingthetechnical andeconomicpotentialofintegratingbioenergyproductionwithinpulpandpaper mills.http://dx.doi.org/10. 1016/j.biombioe. 2014. 02. 024)。由此導(dǎo)致一些企業(yè)停產(chǎn) 倒閉。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)木質(zhì)纖維素原料制備微生物油脂成本高，不宜放大，以及制漿造紙企業(yè)產(chǎn)能 過(guò)剩的問(wèn)題，本發(fā)明人進(jìn)行了大量的科學(xué)研究和創(chuàng)造性的工作，提出了整合亞銨法制漿和 發(fā)酵技術(shù)制備微生物油脂的新方法。本發(fā)明易于操作和放大，可有效改善微生物油脂發(fā)酵 的經(jīng)濟(jì)性，降低微生物油脂生產(chǎn)成本。拓展傳統(tǒng)造紙工業(yè)紙漿應(yīng)用范圍，增加制漿造紙行業(yè) 利潤(rùn)。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0008] 1、紙漿的制備：將天然木質(zhì)纖維素原料根據(jù)以下亞銨法制漿工藝（侯永發(fā)等.馬 尾松亞銨法制漿.林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè)，1981，2)進(jìn)行預(yù)處理。洗滌過(guò)濾后的再生木質(zhì)纖維素。
[0010] 2、含油菌體通過(guò)以下方法獲得：
[0011] (1)分步糖化油脂發(fā)酵：
[0012] a、紙漿酶解：將篩選后所得的紙漿進(jìn)行酶解12_72h，纖維素酶添加量為 10-30FPU/g干紙漿，木聚糖酶添加量為0.l-10mg/g干紙漿，酶解條件為pH4-6,溫度 40-60。。。
[0013]b、調(diào)整酶解水解液中總還原糖濃度在30_150g/L，在其中加入酵母粉0.l_2g/L， 硫酸銨0. 5-5g/L，磷酸二氫鉀0. 1-lg/L，七水硫酸鎂0. 5-3g/L，滅菌后接入產(chǎn)油微生物，在 溫度25-35°C，pH4. 5-6,溶氧大于20%條件下進(jìn)行批式發(fā)酵，獲得含油菌體；或
[0014]c、調(diào)整酶解水解液中總還原糖的濃度在30_300g/L，在其中加入酵母粉0?I-IOg/ L，硫酸銨0. 5-10g/L，磷酸二氫鉀0.l-10g/L，七水硫酸鎂0. 5-10g/L，滅菌后接入產(chǎn)油 微生物，在溫度25-35 °C，pH4. 5-6,溶氧大于20 %條件下進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，控制稀釋率為 0.01-0. 12h\獲得含油菌體；或
[0015]d、調(diào)整酶解水解液中總還原糖的濃度在30-300g/L，在其中加入酵母粉0?I-IOg/ L，硫酸銨0. 5-10g/L，磷酸二氫鉀0.l-10g/L，七水硫酸鎂0. 5-10g/L，滅菌后接入產(chǎn)油微生 物，在溫度25-35°C，pH4. 5-6,溶氧大于20%條件下進(jìn)行批式培養(yǎng)，培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期 進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)加含總還原糖150-300g/L水解液進(jìn)行批式補(bǔ)料發(fā)酵，獲得含油菌體。
[0016] (2)同步糖化發(fā)酵。
[0017] 用水將紙漿調(diào)整到固液比為3% -30%，加入酵母粉0.l-2g/L，硫酸銨0. 5-5g/L， 磷酸二氫鉀〇. 1-lg/L，七水硫酸鎂0. 5-3g/L，滅菌后加入纖維素酶5-20FPU/g(干紙漿）， 木聚糖酶用量為〇. 05-10mg/g(干紙漿），按照0.l-5g/L干細(xì)胞的接種量接入產(chǎn)油微生物， 在溫度25-35°C，pH4. 5-6,溶氧大于20%條件下進(jìn)行同步糖化油脂發(fā)酵，獲得含油菌體；
[0018] 3、微生物油脂提取：本發(fā)明參考文獻(xiàn)（LiYH，ZhaoZB，BaiFW.High-density cultivationofoleaginousyeastRhodosporidiumtoruloidesY4infed-batchculture. EnzymeMicrobTechnol. 2007, 41，312-317)的方法，在發(fā)酵結(jié)束后，經(jīng)離心、洗滌，收集菌體 沉淀。菌體在l〇5°C干燥至恒重，即得干菌體。參照文獻(xiàn)（李植峰，張玲，沈曉京，等.四 種真菌油脂提取方法的比較研究.微生物學(xué)通報(bào)，2001，28 (6)，72-75)使用酸熱-有機(jī)溶 劑法抽提獲得油脂，計(jì)算菌體油脂含量。
[0019] 本發(fā)明使用產(chǎn)油微生物是指發(fā)酵培養(yǎng)后在胞內(nèi)積累油脂超過(guò)其生物總量 20% (w/w)的真核或原核微生物。它們包括但不限于，產(chǎn)油細(xì)菌，如Arthrobacter屬、 Rhodococcus屬或Mycobacterium屬等；產(chǎn)油酵母菌，如Candida屬、Cryptococcus 屬、Hansenula屬、Lipomyces屬、Rhodosporidium屬、Rhodotorula屬、Endomyces屬、 Schwanniomye屬、Trichosporon屬、Sporobolomyces屬，Trigonopsis屬或Yarrowia屬 等；產(chǎn)油霉菌，如Mortierella屬、Cunninghamella屬、Mucor屬或Aspergillus屬等；產(chǎn) 油微藻，如Crypthecodinium屬、Botryococcus屬、Chlorella屬、Nannochloropsis屬、 Haliphthoros屬或Schizochytrium屬等。這些菌株可以直接從包括中國(guó)普通微生物菌種 保藏管理中心（CGMCC)、美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC)以及中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管 理中心（CICC)等菌種保藏機(jī)構(gòu)購(gòu)買或從自然界中分離，也可以使用與原來(lái)菌株性狀不同 的人工或自然突變菌株。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及有益效果：與現(xiàn)有天然木質(zhì)纖