一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)米爾貝霉素的方法及其發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及米爾貝霉素生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)米爾貝霉素的方法及其發(fā)酵培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002]米爾貝霉素(Milbemycins)是由鏈霉菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，包括一系列結(jié)構(gòu)上非常類似的十六元環(huán)類組分。米爾貝霉素具有強(qiáng)烈的殺蟲、殺螨、驅(qū)蟲及抗腫瘤等生物學(xué)活性，大多數(shù)對(duì)農(nóng)業(yè)害蟲具有廣譜防治活性，用于防治如蚜、螨、黃褐天幕毛蟲、腸道寄生蟲以及其他危害作物及家畜的寄生蟲。米爾貝霉素具有作用強(qiáng)烈，用藥量少，對(duì)人安全無毒，不污染環(huán)境，只殺害蟲，不殺害蟲天敵等特點(diǎn)?？勺鳛榉乐乖擃愃幬锂a(chǎn)生抗性的復(fù)配及輪換用藥，是目前最有前途的廣譜高效新型無交叉抗性的生物殺蟲劑。
[0003]米爾貝霉素自1967年首次被日本Sankyo公司發(fā)現(xiàn)，以后該公司又相繼發(fā)現(xiàn)milbemycin A3,milbemycin A4,milbemycin 等組分。美國(guó) American Cyanamid 公司發(fā)現(xiàn)了另一組分LL-28249-α (Nemadectin,尼莫克汀)。目前國(guó)際上已有多個(gè)米爾貝霉素類藥品實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化，被廣泛地用作獸醫(yī)藥物或作物保護(hù)農(nóng)藥，有專家預(yù)測(cè)，它可以替代目前使用于作物保護(hù)的有機(jī)磷氨基甲酸酯擬除蟲菊酯類及有機(jī)氯類化合物，顯示出廣闊的應(yīng)用市場(chǎng)。
[0004]米爾貝廂(miIbemycinoxime)是鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的米爾貝霉素A3和米爾貝霉素A 4基礎(chǔ)上的半合成的肟衍生物，是一種新型的大環(huán)內(nèi)酯類驅(qū)蟲藥，對(duì)體內(nèi)外寄生蟲均具有驅(qū)殺作用，對(duì)控制和預(yù)防大部分常見寄生蟲疾病都有很好的效果。通常用來預(yù)防惡絲蟲病，控制線蟲、鉤蟲引發(fā)的犬、貓疾病及犬的鞭蟲病。米爾貝肟是公認(rèn)的具有廣譜、高效、安全的驅(qū)蟲藥，特別是對(duì)一些伊維菌素敏感的犬相對(duì)更為安全。目前在國(guó)內(nèi)市售的米爾貝肟相關(guān)產(chǎn)品有用于防犬心絲蟲病的片劑“犬心安(milbemycin A )”和用于抗犬、貓耳螨的滴劑“耳螨滅(milbeMite )”等。這些都是進(jìn)口藥物，由瑞士諾華制藥廠或日本三共株式會(huì)社生產(chǎn)，國(guó)內(nèi)尚未開發(fā)出此類產(chǎn)品。
[0005]雖然米爾貝霉素系列產(chǎn)品具有廣泛的用途和市場(chǎng)，但由于只有日本擁有菌種資源,全球一直只有日本Sankyo公司生產(chǎn)milbemycin A1^PA4原藥。我國(guó)東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向文勝等也分離到了產(chǎn)米爾貝霉素的菌株，冰城鏈霉菌i^treptomyces bingchenggensis),經(jīng)過菌株誘變育種改良和發(fā)酵工藝優(yōu)化，米爾貝霉素的產(chǎn)量可達(dá)1380 μ g/mL。進(jìn)一步利用基因工程技術(shù)進(jìn)行菌株改造，米爾貝霉素的產(chǎn)量得到了大幅提高，達(dá)2312 μ g/mL(專利申請(qǐng)?zhí)?201310409240.2)。通過菌株改良是提高米爾貝霉素發(fā)酵效價(jià)和生產(chǎn)能力的有效途徑。但是這樣的改變途徑技術(shù)難度大，成本高，耗時(shí)長(zhǎng)，成功率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種改良的一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)米爾貝霉素的方法，顯著提高了米爾貝霉素的產(chǎn)量，簡(jiǎn)單易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0007]本發(fā)明的還提供了一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)米爾貝霉素用發(fā)酵培養(yǎng)基，通過培養(yǎng)基的改良來提高米爾貝霉素的發(fā)酵水平，顯著提高了米爾貝霉素的產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本。
[0008]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)米爾貝霉素的方法，所述方法包括如下步驟:
(I)斜面活化培養(yǎng):取保存的菌種，接種到斜面培養(yǎng)基，接菌后置于28°c的培養(yǎng)箱中，相對(duì)濕度40-60%，培養(yǎng)8-9d，得到活化菌種；
(2 )種子擴(kuò)大培養(yǎng):從斜面培養(yǎng)基取種，用無菌接種環(huán)在無菌條件下從斜面培養(yǎng)基上刮下孢子制成孢子懸液，使其濃度為17-1O8個(gè)孢子/mL，然后取孢子懸液接種到種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速220r/min，培養(yǎng)時(shí)間46_48h，得到種子液；
(3)發(fā)酵培養(yǎng):將所得種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速220r/min下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間150-180h ；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比計(jì)的原料混合制成:蔗糖12-13%，棉籽餅粉0.8-1.2%，花生餅粉0.8-1.2%，脫脂奶粉0.8-1.2%，番茄醬2-2.5%，磷酸氫二鉀0.1-0.15%，大豆生物炭粉0.1-0.2%，硫酸亞鐵0.01-0.015%，沸石粉0.38-0.42%，鑰酸鈉0.004-0.006%，硫酸銅 0.004-0.006%，碳酸鈣 0.28-0.32%，水余量，pH 7.2-7.6。
[0009]本發(fā)明利用代謝工程原理和技術(shù)，對(duì)影響米爾貝霉素生物合成途徑進(jìn)行深入分析，以通過增加激活米爾貝霉素生物合成相關(guān)的酶(如金屬離子鑰酸鈉、硫酸銅等添加)和盡量增加米爾貝霉素前體物(棉籽餅粉、花生餅粉等成分中可能含有米爾貝霉素生物合成所需的前體物質(zhì))等方法，找到了最佳的培養(yǎng)基組分的組合，顯著提高了米爾貝霉素的產(chǎn)量。大豆生物炭粉具有較大的比表面積，更夠給微生物的繁殖提供較佳的生存環(huán)境，利于鏈霉菌的發(fā)酵，同時(shí)，大豆生物炭粉能夠提供部分發(fā)酵所需的微量元素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而提高了米爾貝霉素的產(chǎn)量。尤其是加入番茄醬、棉籽餅粉、花生餅粉、脫脂奶粉、大豆生物炭粉、沸石粉、鑰酸鈉、硫酸銅等成分及其含量的控制，有效提高了米爾貝霉素的效價(jià)。
[0010]作為優(yōu)選，所述斜面培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比計(jì)的原料混合制成:蔗糖0.3%，脫脂奶粉0.1%，酵母抽提物0.15%，麥芽提取物0.4%，瓊脂2.5%，水余量，pH 7.2±0.1。
[0011]作為優(yōu)選，所述種子培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比計(jì)的原料混合制成:蔗糖1.5%，蛋白胨0.35%，酵母抽提物0.5%，脫脂奶粉0.2%，磷酸氫二鉀0.05%，消沫劑GPE 0.04%，水余量，pH 7.0-7.4。
[0012]作為優(yōu)選，步驟(3)中種子液接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5-15%。
[0013]作為優(yōu)選，所述大豆生物炭粉的制備方法為:將大豆在400-600°C低溫下裂解5-10小時(shí)，冷卻，粉碎至400-800目。本發(fā)明通過對(duì)大豆進(jìn)行低溫裂解，這樣獲得高比表面積的生物炭，同時(shí)，在這樣低溫下裂解，大豆生物炭粉中能夠存在更多有利于鏈霉菌發(fā)酵吸收的微量元素。
[0014]一種鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)米爾貝霉素用發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比計(jì)的原料混合制成:蔗糖12-13%，棉籽餅粉0.8-1.2%，花生餅粉0.8-1.2%，脫脂奶粉0.8-1.2%，番茄醬2-2.5%，磷酸氫二鉀0.1-0.15%，大豆生物炭粉0.1-0.2%，硫酸亞鐵0.01-0.015%,沸石粉 0.38-0.42%,鑰酸鈉 0.004-0.006%,硫酸銅 0.004-0.006%,碳酸鈣0.28-0.32%，水余量。
[0015]作為優(yōu)選，所述大豆生物炭粉的制備方法為:將大豆在400-600°C低溫下裂解5-10小時(shí)，冷卻，粉碎至400-800目。
[0016]作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH控制為7.2-7.6。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:通過培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝的改良來提高米爾貝霉素的發(fā)酵水平，顯著提高了米爾貝霉素的產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本，簡(jiǎn)單易行，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面通過具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0019]本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0020]實(shí)施例1:
鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)米爾貝霉素的方法包括如下步驟:
(I)斜面活化培養(yǎng):取保存的菌種(冰城鏈霉菌CGMCC N0.1734)，接種到斜面培養(yǎng)基，接菌后置于28°C的培養(yǎng)箱中，相對(duì)濕度40%，培養(yǎng)9d，得到活化菌種。
[0021]斜面培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比計(jì)的原料混合制成:蔗糖0.3%，脫脂奶粉0.1%，酵母抽提物(市售)0.15%，麥芽提取物(市售)0.4%，瓊脂2.5%，水余量，pH 7.2±0.1，121。。下滅菌20 min,制成斜面。
[0022]( 2 )種子擴(kuò)大培養(yǎng):從斜面培養(yǎng)基取種，用無菌接種環(huán)在無菌條件下從斜面培養(yǎng)基上刮下孢子制成孢子懸液，使其濃度為17個(gè)孢子/mL，然后取2mL孢子懸液接種到種子培養(yǎng)搖瓶中，種子培養(yǎng)搖瓶中種子培養(yǎng)基裝液量為10mL/ 1000 mL，培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速220r/min,培養(yǎng)時(shí)間48h，得到種子液。
[0023]種子培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比計(jì)的原料混合制成:蔗糖1.5%，蛋白胨0.35%，酵母抽提物0.5%，脫脂奶粉0.2%，磷酸氫二鉀0.05%,消沫劑GPE (市售)0.04%,水余量，pH7.0,121°C下滅菌 20 min。
[0024](3)發(fā)酵培養(yǎng):將所得種子液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，種子液接種量為發(fā)酵培養(yǎng)基體積的5%，培養(yǎng)溫度28°C，搖床轉(zhuǎn)速220r/min下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間180h。
[0025]發(fā)酵培養(yǎng)基由以下質(zhì)量百分比計(jì)的原料混合制成:蔗糖12%，棉籽餅粉0.8%，花生餅粉1.2%，脫脂奶粉0.8%，番茄醬2.5%，磷酸氫二鉀0.1%，大豆生物炭粉0.1%，硫酸亞鐵0.01%，沸石粉0.42%，鑰酸鈉0.004%，硫酸銅0.006%，碳酸鈣0.28%，水余量，pH 7.2，