酵母重組表達門冬胰島素的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)下重組蛋白的制備領(lǐng)域。本發(fā)明公開了由酵母重組表達門冬 胰島素的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是胰島素分泌缺陷或胰島素抵抗導致的以高血糖為特征的代謝紊亂病癥。 目前，中國已成為世界上糖尿病患者人數(shù)最多的國家。糖尿病已成為僅次于心腦血管疾病 和腫瘤的第三大危害性疾病。糖尿病患者常常伴有多種并發(fā)癥，容易導致腎臟、眼、心臟和 血管等眾多器官損害、功能性障礙和衰竭，危害性極大。
[0003] 由于飯后葡萄糖的峰值與注射胰島素的峰值到達時間的偏離，給胰島素注射液的 應用帶來困難，從而推動了單體胰島素類似物的產(chǎn)生。上世紀末，人們開發(fā)出了速效胰島 素一重組門冬胰島素，是將人胰島素B鏈B28位脯氨酸（Pro)突變?yōu)樘扉T冬氨酸（Asp)。此 改變，破壞了兩個胰島素單體分子在形成二聚體時重要的范德華力，使其不易形成二聚體。 重組門冬胰島素制劑注射后，其藥代動力學接近人胰島素的生理分泌曲線。與常規(guī)人胰島 素相比，其藥代動力學特性是常規(guī)人胰島素的一半左右，起效時間為10~20分鐘，達到峰值 時間為40分鐘，作用持續(xù)時間:T5小時，既有效控制了血糖，也不會造成夜間嚴重的低血糖 事件。
[0004] 在中國專利CN98813941. 3中，公開了一種制備重組胰島素類似物的方法，該方法 在獲得正確構(gòu)象的胰島素原后，先用胰蛋白酶酶切，形成具有正確構(gòu)象的Arg(B31)-胰島 素，純化后再用羧肽酶B去除Arg(B31)-胰島素C端的Arg，形成正確構(gòu)象的胰島素，最后再 用HPLC純化。
[0005] 在中國專利CN103305581A中，公開了一種制備重組胰島素的方法，該方法中通過 用胰蛋白酶酶切，然后偶聯(lián)B30的蘇氨酸，最后得到普通胰島素。但其方法不適合門冬胰島 素的制備，因胰蛋白酶無法酶切B28-29為Asp-Lys的Lys的羧基端肽鍵。
[0006] 在中國專利CN102159588A中，公開了一種制備門冬胰島素的方法，該方法中通過 構(gòu)建含有B30蘇氨酸的門冬胰島素原，然后胰蛋白酶和羧肽酶B同時酶切門冬胰島素原的 方法，獲得門冬胰島素。該方法的得率低于70%，且酶用量偏高。
[0007] 在中國專利CN1589328A中，公開了一種制備門冬胰島素的方法，該方法中通過選 用無色桿菌蛋白酶I酶切，酶切完成后直接改變條件轉(zhuǎn)肽，偶聯(lián)蘇氨酸酯。
[0008] 本發(fā)明專利中公開了重組門冬胰島素的制備方法。該方法通過巴斯德畢赤酵母分 泌表達含有三對二硫鍵正確構(gòu)象的門冬胰島素原后，用賴氨酰內(nèi)肽酶高效單一酶切，得到 缺失B30位的門冬胰島素，然后在賴氨酰內(nèi)肽酶作用下偶聯(lián)叔丁醚蘇氨酸叔丁酯(蘇氨酸 酯);再脫去保護基團，經(jīng)反相精純化和結(jié)晶，得到重組門冬胰島素。本發(fā)明工藝中，酶切、偶 聯(lián)效率高，且偶聯(lián)后相關(guān)物質(zhì)的反相色譜中行為差異顯著，易于精純化，更適合工業(yè)化制備 重組門冬胰島素。
[0009]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明提供了重組門冬胰島素新的表達途徑，以及重組門冬胰島素原單一酶切和 偶聯(lián)方法，從而提高重組門冬胰島素的工藝水平和生產(chǎn)能力。
[0011] 本發(fā)明中，重組門冬胰島素制備工藝具體包括以下步驟： i) 通過酵母發(fā)酵獲得正確構(gòu)象的門冬胰島素原； ii) 金屬螯合層析和陽離子交換層析純化門冬胰島素原； iii) 選用賴氨酰內(nèi)肽酶酶切門冬胰島素原，獲得缺失B30位的門冬胰島素； iv〇>B30位偶聯(lián)蘇氨酸酯； V) 反相純化步驟辦樣品； VI)步驟V樣品的脫保護及反相精純化； 油.）結(jié)晶步驟遠樣品。
[0012] 本發(fā)明中，步驟i)的重組門冬胰島素是通過畢赤酵母或釀酒酵母發(fā)酵獲得，優(yōu)選巴 斯德畢赤酵母。
[0013] 步驟ii)中，采用銅離子螯合層析和SP陽離子交換層析純化重組門冬胰島素原。螯 合層析用IOOmM咪唑洗脫，陽離子交換層析用I.OMNaCl洗脫。
[0014]步驟iii)中賴氨酰內(nèi)肽酶（LysylEndopeptidase，Lys-C),也被稱為賴氨酰肽鏈內(nèi) 切酶酶切重組門冬胰島素。該酶可以特異性切除賴氨酸殘基羧基端肽鍵，其最適活性PH為 9. (T9. 5。酶切緩沖可以為Tris-HCl緩沖液、磷酸鹽緩沖、硼酸鹽緩沖，優(yōu)選Tris-HCl緩沖 鹽；其離子強度為20~100禮，優(yōu)選30~60禮。賴氨酰內(nèi)肽酶與門冬胰島素原的質(zhì)量比介于 1:3000~30000,優(yōu)選1:5000~20000時酶切效率達95%左右。
[0015] 步驟SO中，酶切獲得的缺失B30門冬胰島素偶聯(lián)蘇氨酸酯。具體為反應體系中蛋 白濃度為l(T30g/L，DMF/EtOH(V/V)體積分數(shù)為40-70%，去離子水為10-30%，蛋白與叔丁 醚蘇氨酸叔丁酯(蘇氨酸酯）質(zhì)量之為l:3~20，pH為5. 5~8. 5,反應溫度為20~37°C;蛋白濃 度優(yōu)選l(T20g/L，DMF/EtOH(V/V)為優(yōu)選50-60%，去離子水含量優(yōu)選15-20%，蛋白與叔丁 醚蘇氨酸叔丁酯(蘇氨酸酯)質(zhì)量之為l:5~15，pH優(yōu)選6.5~8.0,反應溫度優(yōu)選25~30°C。此 步驟中B30位蘇氨酸偶聯(lián)率達到85~90%。
[0016]步驟W)反相純化步驟樣品。樣品偶聯(lián)完成后，補加2倍體積冷乙腈，在Waters SunfireC8反相色譜層析柱中，用含有0. 1~0. 2M硫酸銨的乙腈緩沖液梯度洗脫，目的蛋白產(chǎn) 物的純度達到98%。
[0017] 步驟訪，步驟V純化樣品脫保護。選取3(Tl00%TFA的二氯甲烷（DCM)，按蛋白含量 (mg)與DCM/TFA混合液體積（ml)比為10~50 :1補加DCM/TFA混合液，反應溫度為10~25°C，反應時間0. 5~1. 5小時。優(yōu)選5(Tl00%TFA的DCM，蛋白與TFA/DCM混合液之比優(yōu)選10~30:1， 反應溫度優(yōu)選15~20°C，反應時間優(yōu)選0. 5~1小時。反應完全后，用去離子水稀釋30~40倍， 補加5%乙腈，在SP-120-5-C8-BI0 (Daisogel)的色譜柱中，按照步驟w的方法洗脫樣品。 精純化獲得重組門冬胰島素的純度達到99%。
[0018] 步驟沾）結(jié)晶，先將步驟政樣品真空低溫凍干，在10~30°C條件下，配置含20~200mM 檸檬酸三鈉、3. (TlO.Og/L重組門冬胰島素、體積分數(shù)為10~30%的乙醇、0. 2~0. 5%的間甲 酚、0. 2~1.OM氯化鈉結(jié)晶液、并調(diào)節(jié)結(jié)晶液pH至6. (T6. 5、按鋅離子與門冬胰島素的摩爾比 為2~15:1補加鋅離子，結(jié)晶3~6小時，然后降溫至2~8°C靜置10~20小時，獲得門冬胰島素 結(jié)晶。
[0019] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點： (1)賴氨酰內(nèi)肽酶單一酶切門冬胰島素原，酶切效率高和錯切率極低的優(yōu)點。
[0020] (2)B30位蘇氨酸酯的偶聯(lián)率高。
[0021] (3)反相粗純化和精純化的分離效果高且具有較高回收率。
[0022]
【附圖說明】
[0023] 圖1:重組人門冬胰島素原酶切前后反相色譜圖。其中，圖a是門冬胰島素原酶切 前的RP-HPLC分析圖；圖b為門冬胰島素原酶切后的RP-HPLC分析圖。
[0024] 圖2 :DesB30-門冬胰島素偶聯(lián)蘇氨酸酯的RP-HPLC檢測圖。
[0025] 圖3 :DesB30-門冬胰島素偶聯(lián)產(chǎn)物反相純化圖。
[0026] 圖4 :DesB30-門冬胰島素偶聯(lián)產(chǎn)物純化后RP-HPLC分析圖。
[0027] 圖5 :DesB30-門冬胰島素偶聯(lián)產(chǎn)物脫去保護基團并反相純化后RP-HPLC分析圖。
[0028] 圖6:重組門冬胰島素結(jié)晶后在顯微鏡下64倍放大圖。
[0029] 圖7 :重組門冬胰島素的質(zhì)譜。
[0030] 具體實施方案
[0031]以下結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明。本發(fā)明的優(yōu)點和特點將隨著描述而更 為清楚。但這些實例僅是范例，不對發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應該理解 的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替 換，但這些修改或替換均落入落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0032] 實例1.重組門冬胰島素上游構(gòu)建與篩選 (1)以重組人門冬胰島素原氨基酸序列設(shè)計其cDNA序列，并在序列后面設(shè)計TGA和TAA兩個終止密碼子序列，在序列3 '端和5 '端分別設(shè)計XhoI(CTCGAG)和NtoI(GCGGCCGC) 限制性酶切位點。委托大連TAKARA工程有限公司進行全基因合成。
[0033] (2)將上述全基因合成的Pro-AspcDNA插入PMD18-T-Pro-Asp質(zhì)粒。用限制性內(nèi) 切酶分別酶切PMD18-T-Pro-Asp和pPICZaA后回收兩個目的片段（Pro-Asp和pPICZaA 大片段)，經(jīng)T4鏈接并轉(zhuǎn)化到P.PastorisX-33宿主菌中，得到工程菌（pPICZaA-Pro-Asp/ X-33)〇
[0034] (3)通過篩選高效表達的工程菌，并優(yōu)化發(fā)酵工藝，獲得重組門冬胰島素原。
[0035]SEQIDNO:I(InsulinAspart氨基酸序列 1):

實例2.門冬胰島素制備 (1)純化獲得門冬胰島素原和酶切獲得缺失B30-門冬胰島素：巴斯德畢赤酵母發(fā)酵液 5L，離心，上清過銅離子螯合層析和SP陽離子交換層析獲得門冬胰島素原；然后補加20mM Zn離子沉淀門冬胰島素原，離心，沉淀用100mL50mMTris溶解，蛋白含量為lg，pH調(diào)到 8.8,按酶與蛋白質(zhì)量比為1:5000補加賴氨酰內(nèi)肽酶（Lys-C)O. 2mg，30°C攪拌酶切。16小 時后，取樣RP-HPLC分析，酶切效率達到90%，調(diào)pH5. 5等電點沉淀。
[0036] (2) desB30-門冬胰島素偶聯(lián)，得到門冬胰島素酯：取等電點沉淀desB30-門冬胰 島素離心，用5ml 10%冰醋酸溶解，蛋白濃度為80mg/ml，6ml，緩慢補加DMF/EtOH(V/V=l:l) 混合液18ml，補加叔丁醚蘇氨酸叔丁酯6ml (6g左右），pH調(diào)到8.0,按1:500補加Lys-C lmg，30 °C攪拌偶聯(lián)。
[0037] (3)門冬胰島素酯的純化及脫酯：偶聯(lián)反應48小時后，取樣RP-HPLC分析，偶聯(lián)率 為85%。補加120ml冷乙腈沉淀門冬胰島素酯，用400ml 20%乙腈溶解沉淀，pH調(diào)到2. 5。 樣品用Waters Sunfire C8純化（A液：0. 2M硫酸銨，pH2. I ;B液：0.1 M硫酸銨，40%乙腈）回 收門冬胰島素酯。取純度95%以上樣品低溫真空凍干。取300mg門冬胰島素酯，補加15ml 含50%三氟乙酸（TFA)的二氯甲烷（DCM)，15°C反應1小