一種海灣扇貝多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體講，涉及一種海灣扇貝多肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 海洋肽類因其具有抗腫瘤、抗氧化、抗真菌、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等生理活性，成為 目前海洋性功能成分的研究熱點(diǎn)之一。海灣扇貝（argopectenirradias)屬瓣鮑綱，異柱 目，扇貝科，扇貝屬，粗蛋白含量為12%左右，氨基酸組成均衡，因此海灣扇貝是海洋肽類開 發(fā)利用的理想原料之一，但國內(nèi)外有關(guān)海灣扇貝多肽提取工藝的研究尚無報(bào)道。
[0003] 研究表明，海洋多肽的生理作用與組成多肽的氨基酸序列有關(guān)；一些生物活性肽 的生理功能還與多肽的結(jié)構(gòu)、疏水性、所帶電荷等有關(guān)。
[0004] 惡性腫瘤又稱為癌癥，是目前嚴(yán)重威脅人類生命和影響人類健康的主要疾病之 一。海洋生物來源的抗腫瘤活性物質(zhì)具有毒副作用小、藥效高的特點(diǎn)，現(xiàn)已成為天然抗癌藥 物極好的潛在資源。扇貝是海洋生物的一種，因其營養(yǎng)價(jià)值高且含有多種生理活性成分，在 海洋抗癌藥物研究中具有很好的應(yīng)用和開發(fā)前景。
[0005] 關(guān)于海洋多肽的研究，已公開一些相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)。
[0006] 專利申請200810189188. 3公開了文蛤活性多肽在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用，該 申請采用鹽析醇沉的方法制備得到文蛤活性多肽，采用MTT法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯 示，文蛤多肽對肺癌細(xì)胞A549具有特異的誘導(dǎo)殺死效應(yīng)，對肺癌細(xì)胞A549有明顯的抑制作 用。
[0007] 專利ZL201110036545. 4公開了一種文蛤多肽及其制備方法，該文蛤多肽N-末端 序列為IDEIQNTGGGTNFR，其分子量為15Ku，其制備方法為將文蛤體液經(jīng)過硫酸銨分級(jí)沉 淀、超濾、離子交換層析、疏水層析、反相層析后獲得一種分子量為15Ku的多肽。用MTT比 色法檢測其抗腫瘤活性，發(fā)現(xiàn)該化合物能顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，但對正常細(xì)胞沒 有抑制作用。
[0008]目前，有關(guān)扇貝多肽結(jié)構(gòu)及生理功能的研究多見于櫛孔扇貝多肽，而海灣扇貝多 肽（polypeptidefromargopectenirradias，PAI)的相關(guān)研究尚屬空白。為次，特提出本 發(fā)明。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出了一種海灣扇貝多肽。
[0010] 本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出該海灣扇貝多肽的用途。
[0011] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用的技術(shù)方案為：
[0012]本發(fā)明涉及一種海灣扇貝多肽，其制備方法包括：對新鮮海灣扇貝進(jìn)行前處理、研 磨、超聲破碎、酶解、超濾和層析；其中，酶解的步驟為：先用復(fù)合蛋白酶處理，再用堿性蛋 白酶處理；復(fù)合蛋白酶處理的條件為：底物濃度為12%~14%、酶用量1200~1400U/g、 pH5. 5~7. 0、溫度50~55°C、時(shí)間1~3h;其中，pH優(yōu)選為6. 5~7. 0、溫度優(yōu)選為50~ 54°C;堿性蛋白酶處理的條件為：底物濃度6 %~8 %、酶用量600~700U/g、pH6.O~8.O、 溫度56~60°C、時(shí)間2~3h;其中，pH優(yōu)選為7. 0~8. 0。
[0013] 本發(fā)明的海灣扇貝多肽的分子量為700~950u，優(yōu)選700~790u。
[0014] 本發(fā)明的第一優(yōu)選技術(shù)方案為：超聲破碎的條件為：溫度50~55°C，功率350w， 超聲和間歇時(shí)間比3 : 1、時(shí)間20~30min。
[0015] 本發(fā)明的第二優(yōu)選技術(shù)方案為：在復(fù)合蛋白酶處理后，經(jīng)過低溫三級(jí)超濾后再堿 性蛋白酶處理，低溫超濾的溫度為5~10°C，截留分子量為0~Iku的蛋白水解物。
[0016] 本發(fā)明的第三優(yōu)選技術(shù)方案為：超濾步驟的條件為：將經(jīng)過兩步水解后的海灣扇 貝水解液依次進(jìn)行三級(jí)超濾，截留分子量為〇~Iku的蛋白水解物。
[0017] 本發(fā)明的第四優(yōu)選技術(shù)方案為：三級(jí)超濾的超濾膜為分別經(jīng)過截留分子量為 10ku、5ku和Iku的超濾膜。
[0018] 本發(fā)明的第五優(yōu)選技術(shù)方案為：層析步驟的條件為：采用SpehadexG-15層析柱 對分子量為0~Iku的組分進(jìn)行分離純化，具體步驟：上樣濃度為20~30mg/mL，上樣量 1~4mL，蒸餾水洗脫流速0. 1~0. 15mL/min。
[0019] 本發(fā)明的第六優(yōu)選技術(shù)方案為：在水解后還包括一個(gè)加熱滅酶的步驟，條件為： 加熱至95~KKTC滅酶15~20min。
[0020] 本發(fā)明還涉及該海灣扇貝多肽在制備預(yù)防或治療癌癥藥物中的應(yīng)用，以及海灣扇 貝多肽在制備預(yù)防癌癥的食品或保健品中的應(yīng)用，癌癥優(yōu)選肝癌。
[0021] 本發(fā)明的復(fù)合蛋白酶選用丹麥諾維信（Novo)公司生產(chǎn)的復(fù)合蛋白酶 Protemax(規(guī)格2. 4AU/g);堿性蛋白酶選用丹麥諾維信（Novo)公司生產(chǎn)的堿性內(nèi)切蛋白酶 Alcalase(規(guī)格I. 5AU/g)。
[0022] 下面對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的解釋和說明。
[0023] 本發(fā)明以海灣扇貝為原料，對海灣扇貝多肽的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，提出了一種產(chǎn) 量高、活性高的海灣扇貝多肽制備方法。此外對其抗腫瘤效果進(jìn)行了研究，研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā) 明的海灣扇貝多肽具有較強(qiáng)的抑制肝癌細(xì)胞生長的作用。
[0024] 本發(fā)明通過對扇貝多肽的深入研究，提出了一種高活性的海灣扇貝多肽，該多肽 具有較小的分子量，經(jīng)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的抑制率試驗(yàn)，表明其具有很強(qiáng)的抑制腫瘤 細(xì)胞的活性。本發(fā)明創(chuàng)新性的使用堿性蛋白酶對扇貝進(jìn)行水解，克服了酸性水解酶酶切位 點(diǎn)不確定的缺陷。為了使扇貝中蛋白質(zhì)充分水解，本發(fā)明使用了兩種蛋白酶分別水解，不僅 避免了兩種水解酶共同作用對蛋白質(zhì)大分子的共同剪切作用從而造成游離氨基酸含量增 加的缺陷，并且最大限度的對蛋白質(zhì)大分子片段進(jìn)行了水解，提高了目的多肽的產(chǎn)量，水解 率可達(dá)到48. 10%。
[0025] 本發(fā)明中水解率的計(jì)算方式為：
[0026] DH(% )=(氨基酸態(tài)氮的質(zhì)量/樣品中總氮的質(zhì)量）X100%
[0027] ①總氮含量：樣品中總氮含量的測定采用凱氏定氮法。
[0028] ②氨基酸態(tài)氮含量：采用甲醛電位滴定法進(jìn)行滴定，按如下公式計(jì)算。
[0030] X-氨基酸態(tài)氮含量，g/100mL;
[0031]C-NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L;
[0032]V1-測定試樣稀釋液加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;
[0033]V2-空白滴定加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL;
[0034]V3-試樣稀釋液取用量，mL;
[0035] 0? 014-與I.OOmLNaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g。
[0036] 本發(fā)明涉及一種海灣扇貝多肽的制備方法包括：對新鮮海灣扇貝進(jìn)行前處理、研 磨、超聲破碎、酶解、超濾和層析。
[0037] 本發(fā)明選用了在研磨后進(jìn)行超聲破碎的步驟，節(jié)約水解的時(shí)間，避免游離氨基酸 含量增高，可提高水解效率。
[0038] 本發(fā)明創(chuàng)新的采用了兩步酶解的方法對海灣扇貝進(jìn)行水解，先用復(fù)合蛋白酶處 理，再用堿性蛋白酶處理。并對復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶的酶解處理?xiàng)l件進(jìn)行了優(yōu)化選擇。 在選用復(fù)合蛋白酶處理中，選擇了高底物濃度、高酶用量的處理方式；在采用堿性蛋白酶處 理過程中，選用了低底物濃度和低酶用量的處理?xiàng)l件，并分別對pH值和處理溫度進(jìn)行了優(yōu) 化。單酶法水解存在酶水解度較低、耗時(shí)長及多肽得率低等缺點(diǎn)；而將幾種酶結(jié)合起來使用 則可以提高酶解效率。因此，從水解度和多肽得率等方面綜合考慮，本發(fā)明選用水解度較高 的復(fù)合蛋白酶和堿性蛋白酶進(jìn)行分步水解，以求得到水解度高，低分子量的海灣扇貝多肽。 經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明采用不同的酶接力水解，所達(dá)到的水解度及多肽得率均高于加入單種 水解酶水解、以及一次性加入混合酶水解。
[0039] 通過對蛋白水解產(chǎn)物的進(jìn)一步純化，得到了分子量為700~790u的多肽產(chǎn)物，經(jīng) 人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的生長抑制試驗(yàn)，證明其具有更強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞的活性。
[0040] 在對蛋白水解物的純化過程中，先對經(jīng)過兩步水解的產(chǎn)物進(jìn)行三級(jí)超濾，分別經(jīng) 過截留分子量為l〇ku、5ku和Iku的超濾膜，獲得不同分子質(zhì)量的濾液組分：>IOku組分、 5ku~IOku組分、Iku~5ku組分、0~Iku組分。然后對含有本發(fā)明活性多肽的0~Iku 組分進(jìn)行層析，以獲得特定分子量大小的目的多肽。層析采用SpehadexG-15層析柱，該柱 依據(jù)分子篩效應(yīng)分離原理，具有穩(wěn)定性好，分離度高等優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)層析處理后，目的多肽的純 度可以達(dá)到83%。
[0041] 在本發(fā)明的某一優(yōu)選實(shí)施方式中，在復(fù)合蛋白酶處理后，可以先經(jīng)過低溫超濾，再 進(jìn)行堿性蛋白酶處理，低溫超濾的溫度為5~KTC，先把分子量為0~Iku的多肽截留出 來，避免在后續(xù)的酶處理過程中的過度分解。
[0042] 以往對活性物質(zhì)進(jìn)行體外抑瘤活性檢測的報(bào)道中，多采用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法 (MTT法），與MTT相比，WST-8具有操作簡化、結(jié)果更加穩(wěn)定、線性范圍更寬、靈敏度更高的 優(yōu)點(diǎn)。為此，本發(fā)明選用CCK-8法檢測海灣扇貝多肽對人肝癌SMMC-7721細(xì)胞的增殖抑制 作用，結(jié)果表明，不同濃度（4mg/mL、8mg/mL和12mg/mL)的海灣扇貝多肽在24h能顯著抑制 SMMC-7721細(xì)胞的增殖，隨著海灣扇貝多肽濃度的提高，抑制效果逐漸增強(qiáng)，12mg/mL海灣 扇貝多肽組的效果最明顯。說明，本發(fā)明的海灣扇貝多肽能夠抑制體外培養(yǎng)的SMMC-7721 細(xì)胞增殖，具有抗腫瘤活性。
[0043] 在細(xì)胞凋亡研究中流式細(xì)胞術(shù)能夠較準(zhǔn)確地測出凋亡細(xì)胞占所測總細(xì)胞的百分 含量。本發(fā)明用AnnexinV-PE/7-AAD雙染細(xì)胞凋亡試劑盒經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測SMMC-7721 細(xì)胞的凋亡情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，不同濃度海灣扇貝多肽處理組的SMMC-7721細(xì) 胞均出現(xiàn)一定程度的凋亡，且隨