一種鑒定低酚棉花品種的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒定低酚棉花品種的方法，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 棉花是我國主要的經(jīng)濟作物，集纖維、蛋白、油用于一體，其中棉纖維已得到充分 利用；蛋白、油來源于棉籽，棉籽中除了含有18 % -20 %的油脂外，還含有22 % -24 %的蛋白 質(zhì)。棉籽榨油后的棉仁粉，蛋白質(zhì)含量更可高達45% -50%，遠勝過稻米、小麥、甚至花生、 大豆的蛋白質(zhì)含量，而且含有小麥、稻米以至大豆所欠缺的一些人體所必需的基本氨基酸。 棉仁中還含有35%以上的棉仁油，在食用油中，亞油酸含量最高的莫過于棉仁油。棉仁油的 亞油酸含量高達55. 6%，是一種亞油酸含量極高的高級保健油。因此，棉籽不僅是重要的植 物油料，而且是世界上僅次于大豆的重要植物蛋白資源。但因棉籽中含有對人畜有毒的棉 酚及其衍生物，棉籽蛋白質(zhì)和油用資源的利用一直受到限制。棉酚及其衍生物是對人類和 單胃動物有很高毒性的一種化學(xué)物質(zhì)，但棉株部位的棉酚卻是棉花自身防御病蟲危害的重 要組成部分，植株部位缺少棉酚會導(dǎo)致棉花病蟲的危害而使產(chǎn)量大幅下降。因此，為了提高 棉花的綜合利用價值，科學(xué)家一直將選育不含棉酚的棉花品種作為工作重點。
[0003] 在棉花中已發(fā)現(xiàn)多種類型的低酚基因資源，其中僅有兩種類型即雙隱性低酚 (gl2gl3)和顯性低酚（G12e)具有實際利用價值。Afifi等人通過32P輻射誘變海島棉 (G.barbadenceL.)，獲得一個無腺體突變體，命名為"BahtimllO"。遺傳研究結(jié)果表明，該 性狀受到一對顯性主基因控制，并命名為G12e。它可以有效地抑制棉酚腺體的形成。董承 光利用陸地棉遺傳標準系TM-I和海島棉無腺體突變品系海1構(gòu)建的1599個F2單株，對無 腺體突變基因G12e進行了精細定位。遺傳研究進一步證明，該基因是一不完全顯性單基 因。利用SSR標記將G12e基因定位在CIR362和NAU2251b之間，遺傳距離分別為9. 27和 0. 96cM。經(jīng)典遺傳學(xué)分析表明，gl2和gl3兩對隱性基因控制棉酚發(fā)育，分別位于棉花第12 和26染色體，當兩對隱性基因純合時，棉花植株和棉籽均表現(xiàn)為無腺體。2001年張雪林等 分析湘x9628棉酚發(fā)育特性表明：湘x9628植株有腺體、種子低棉酚特性由二對重疊隱性基 因控制，等位性測驗表明，其中一對基因是gl2的等位基因，另一對是gl3的復(fù)等位基因，它 對gl3表現(xiàn)為隱性，可能是控制棉酚發(fā)育的一個新基因。
[0004] 隨著新技術(shù)在棉花育種中的應(yīng)用，棉花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展越來越快，新品種選育周期縮 短，審定速度加快、品種數(shù)量增多。目前棉花品種選育過程中所用的親本遺傳基礎(chǔ)愈加狹 窄，骨干親本數(shù)量有限且反復(fù)利用，在原品種基礎(chǔ)上改良少數(shù)或單個性狀的衍生品種增多， 一些棉花新品種形態(tài)越來越相似，通過傳統(tǒng)的形態(tài)標記方法鑒別越來越困難，而且鑒定結(jié) 論也常常存在疑問。目前生產(chǎn)中使用的品種存在非常大的類同性，甚至用未審定的假品種 充當新品種，嚴重影響種子市場秩序和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全。因此急需建立一套客觀、可靠、易操 作的鑒別技術(shù)為不同的棉花品種編制對應(yīng)的指紋身份證號。這是司法鑒定品種真實性和純 度的迫切要求，也是對棉花新品種權(quán)保護的重要保證。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，分 子標記技術(shù)由于不受取材部位、取材時間及環(huán)境的影響，已經(jīng)被作為一種進行品種純度和 真實性鑒定的常規(guī)方法。目前，用于鑒定品種的分子標記類型很多，包括RAPD、SSR、ISSR、SRAP、AFLP等，其中SSR標記具有結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好等特點，被認為是進行品種鑒定的一 種比較理想的標記，被廣泛應(yīng)用在棉花品種指紋圖譜構(gòu)建和遺傳多樣性分析中。李成奇等 利用20對SSR核心引物構(gòu)建了百棉系列棉花自交系品種（系）的DNA指紋圖譜。趙亮等 利用26對SSR引物構(gòu)建12個品種DNA指紋圖譜。聶新輝等利用40對SSR引物構(gòu)建了51 份新陸早系列棉花品種的DNA指紋圖譜。
[0005] 低酚棉花品種的選育相對落后，但是隨著中國內(nèi)地棉花種植面積的不斷減少以及 植棉經(jīng)濟效益的降低，棉花育種家會越來越重視特種棉花品種的選育，其中低酚棉的種仁 具有重要利用價值，所以通過選育低酚棉提高棉花的綜合利用價值將會是其中一個重點方 向和熱點內(nèi)容。我國從1986年開始用顯性無腺體海島棉品系海1與早熟、抗病、豐產(chǎn)的陸 地棉雜交，把顯性無腺體基因轉(zhuǎn)入到陸地棉中，首次培育出了顯性無腺體陸地棉新種質(zhì)。目 前已有20多個低酚棉品種通過省級以上審定并命名。低酚棉的種仁棉酚含量達到國家食 用標準（< 0? 02% )和國際食用標準（< 0? 04% )，但是針對低酚棉的品種，還沒有建立起 精確的鑒定技術(shù)和方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是提供一種鑒定低酚棉花品種的方法，通過構(gòu)建低酚 棉品種指紋圖譜，開發(fā)一套鑒定低酚棉品種的分子標記，為區(qū)分和保護不同低酚棉品種提 供技術(shù)支持。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] -種鑒定低酚棉花品種的方法，包括如下步驟：提取各供試材料的基因組DNA，在 棉花26個連鎖群上分別選擇3條SSR引物，以各供試材料的基因組DNA為模板進行PCR擴 增，分析PCR擴增結(jié)果，構(gòu)建各低酚棉花品種的指紋圖譜，篩選出不同品種的特征引物，其 中有53對引物在不同供試材料間表現(xiàn)出穩(wěn)定的多態(tài)性，利用最少2對特征引物組合即可 將低酚棉品種區(qū)分開來；所述的53對引物分別為：NAU4044、NAU5499、JESPR304、NAU5384、 NAU2161、BNL3441、NAU3469、NAU3386、NAU5015、NAU2121、NAU5434、NAU3206、NAU3654、 BNL1604、NAU3964、BNL3255、NAU5318、BNL2590、BNL256、HAU2681、HAU2837、NAU3897、 NAU3778、NAU5204NAU4863、NAU2765、NAU3736、JESPR243、NAU3733、NAU3714、BNL3955、 NAU2907、NAU2162、BNL448、NAU2894、BNL852、NAUl221、BNL3806、BNL827、NAU3906、NAU2734、 NAU2240、NAU5379、NAU5350、BNL3383、NAU5359、NAU3434、NAU4855和HAU2631，詳見表1。
[0009] 表1 53對引物
[0010]

[0012] 前述鑒定低酚棉花品種的方法中，步驟（1)中所述的供試材料為我國審定的低酚 陸地棉品種9份，分別是冀棉19、冀棉21、冀棉27、湘棉18號、遼棉11號、中棉所18、中棉 所20、汾低99和蘇研608,以及低酚海島棉海1和有酚陸地棉品種泗抗1號作為對照品種。
[0013] 前述鑒定低酚棉花品種的方法中，所述的指紋圖譜的構(gòu)建方法為：將對照種的擴 增帶型記為1，后續(xù)泳道中遇到與其帶型一致的記為1，不一致的記為2,遇到與帶型2不一 致的記為3,依次類推。獲得供試品種SSR引物擴增的基因型代碼后，將所有引物擴增基因 型代碼串聯(lián)，按染色體號從小到大，先At亞組后Dt亞組的順序依次排列，作為每一個品種 的數(shù)字指紋。
[0014] 前述鑒定低酚棉花品種的方法中，提取基因組DNA的方法為：
[0015] (1)將5g凍葉或鮮葉放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨，分2次加入IOml新鮮配 制的提取緩沖液，轉(zhuǎn)入50ml的離心管中，渦旋混勻，冰浴保存10min，4°C下4000rpm離心 20min，棄上清；
[0016] (2)于沉淀中加入15ml65°C預(yù)熱的裂解緩沖液，并用銅絲攪松，渦旋混勻，65°C 水浴30min;
[0017] (3)加入15ml體積比為24:1的氯仿和異戊醇的混合液，翻轉(zhuǎn)50次以上，15 °C下 4000rpm離心20min，將上清轉(zhuǎn)入50ml的離心管中，加0. 6體積的預(yù)冷的異丙醇，緩慢翻轉(zhuǎn) 30次，混勾，靜置10min，4000rpm，室溫下離心lOmin，棄上清，于沉淀中加入2ml70%的乙 醇洗滌，并轉(zhuǎn)入IOml的離心管中，1000 Orpm離心5min。倒掉上清液，通風(fēng)干燥20min;
[0018] (4)加3mlTE緩沖液，溶解，65°C培養(yǎng)10~30min，加3ml的體積比為24 : 1的 氯仿和異戊醇混合液，緩慢翻轉(zhuǎn)50次，混勻，室溫靜置5min，1000 Orpm離心IOmin;
[0019] (5)上清液轉(zhuǎn)入IOml離心管中，加0? 1體積的pH為5. 2的3M醋酸鈉，加等體積的 異丙醇后翻轉(zhuǎn)30次，放置30min，1000 Orpm離心5min，棄上清液，加2ml70 %乙醇洗DNA小 團，1000 Orpm離心5min。倒掉上清液，通風(fēng)干燥20min;
[0020] (6)加3mlTE緩沖液溶解，65°C培養(yǎng)10~30min;
[0021] (7)加5yI10mg/ml的RNAaseA，37°C溫育30~60min。加等體積的體積比 為24 : 1的氯仿和異戊醇混合液，緩慢翻轉(zhuǎn)50次，混勻，室溫靜置5min，1000 Orpm離心 IOmin；
[0022] (8)上清液轉(zhuǎn)入IOml離心管中，加0. 1體積的pH為5. 2的3M醋酸鈉，加等體積的 異丙醇后翻轉(zhuǎn)30次；
[0023] (9)將絮狀沉淀挑入加有800y1 70%乙醇的I. 5ml的離心管中，1000 Orpm離心 5min。棄上清液，自然通風(fēng)干燥DNA小團；
[0024] (10)加200yITE緩沖液在4°C下溶解DNAl~2天，-20°C保存；
[0025] (11)以5y1北京天根IOObpDNALadder作為對照，將DNA依次稀釋5倍、10倍 和20倍，通過1 %瓊脂糖凝膠電泳，確