羊衣原體lamp檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種試劑盒，尤其是一種羊衣原體LAMP檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]羊衣原體病是由嬰4鵡熱衣原體(C./wiiiaci)和反當(dāng)動(dòng)物衣原體(C.p ecorum)引起的一種傳染病。鸚鵡熱衣原體臨床上以發(fā)熱、流產(chǎn)和產(chǎn)弱羔為特征，反芻動(dòng)物衣原體引起羊多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎和腸炎，是危害羊的主要疾病之一。該病同樣會(huì)給養(yǎng)羊業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。羊衣原體病在我國一些養(yǎng)羊基地、養(yǎng)羊?qū)I(yè)戶及農(nóng)戶的羊群中存在，嚴(yán)重危害羊只的健康?，F(xiàn)在市場缺少一種能對臨床樣品的羊衣原體進(jìn)行簡便、快捷、靈敏、易推廣的LAMP檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種羊衣原體LAMP檢測試劑盒，它可以快速檢測羊衣原體MOMP基因，并且簡便、靈敏、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)。
[0004]本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的:羊衣原體LAMP檢測試劑盒，它包括濃度為0.5 Mmol/L的引物F3 I μ?、濃度為0.5 Mmol/L的引物Β3 I μ?，濃度為I Mmol/L的引物FIP 2 μ?、濃度為I Mmol/L的引物BIP 2 μ?, Bst DNA聚合酶I μ?，LAMP反應(yīng)緩沖液13μ?，模板1.5μ?,熒光顯色液1KL，用ddH20補(bǔ)足至2.5 μ?,石蠟油1.5_2μ?，2 μ L陰性對照以及2 μ L陽性對照；所述的引物F3的序列為:5’ - acaagcctagaggatacaag-3 ;所述的引物B3的序列為:5，_gttgagcgatgcggatagtg_3 ;所述的引物 FIP 的序列為:5，_agtatccgtagcagcctctgtgaacgtccgccaactttcc _3 ;所述的引物 BIP 的序列為 5，- gtctagcactctcttacagatgtgaccagtttacgccaatg -3’。
[0005]陰性對照為衣原體非特異性DNA片段。
[0006]陽性對照為標(biāo)準(zhǔn)衣原體MOMP基因LAMP產(chǎn)物。
[0007]所述的LAMP 緩沖液中，dNTP 為 0.2 mmol、 Mg2+ 為 I mmolNaCl 為 10 mmol、Tris-HCl 為 5mmol，其 PH 值為 pH8.3。
[0008]為了驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)效果，進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn):
1、材料與方法
1.1材料
1.1.1菌株
衣原體、大腸埃希氏桿菌、沙門氏菌、銅綠假單胞菌、葡萄菌、魏氏梭菌均由貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室和貴州省畜禽重大疫病防制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。標(biāo)準(zhǔn)衣原體疫苗株由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。
[0009]主要試劑
TIANamp血液和糞便基因組DNA提取試劑盒、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法DNA擴(kuò)增試劑盒購自購自天根生化科技有限公司；Goldview、Tris、EDTA、MarkerDL2000、ProteinaseK、RNaseA、Taq DNA Polymerase (lU/KL)、Bst DNA 聚合酶及相應(yīng) 10 X Taq Buffer、dNTP (mix)等購自寶生物(大連)工程有限公司。乙酸鈉、冰乙酸、乙醇等常用試劑均為國產(chǎn)分析純。
[0010]采取的主要研究方法
2.1 DNA的提取
方法一:DNA提取參照TIANamp衣原體基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。挑取少許菌落于1.5ml離心管中加入TE緩沖液稀釋至微濁，取Iml裝入離心管中9000r/min離心10秒，棄上清，在細(xì)菌沉淀管中加入20ulDB液，160ulIysozyme和20ulRNaseA，徹底振蕩懸浮，3 7 °C溫浴45分鐘，期間來回顛倒離心管數(shù)次。加入400ulDL和25ul蛋白消化酶K(ProteinaseK)迅速溫和地來回顛倒離心管徹底混勻。置65°C溫浴45分鐘，離心I分鐘，取上清液。加入200ul異丙醇，劇烈顛倒離心管使溶液混合后，移取600ul至吸附柱中，離心30秒。棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。將剩余的全部移至吸附柱中，離心30秒。棄去收集管中的液體，將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。加入500ulWl液，靜置一分鐘后，離心30秒。將吸附柱放入另外一個(gè)收集管中。加入500ulWl液，離心15秒。棄掉收集管中的液體，再將吸附柱放入同一個(gè)收集管中。離心I分鐘。將吸附柱移入一個(gè)干凈的1.5ml離心管中。在吸附膜中央加入100 UlTl液，65°C靜置5分鐘后，離心I分鐘。將上清液移入1.5ml離心管(DNA) 4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0011]方法二:臨床取樣0.1g病羊病料加入0.5mL0.lmol/L PBS, _20°C反復(fù)凍融3次，研磨制成懸液，然后轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。12000 r/ min離心5 min，取上清液用于衣原體DNA的提取。加入80 uLDNA提取液，混勻，沸水浴10分鐘，離心2分鐘，將上清提取的DNA于-20 °C保存。
[0012]引物設(shè)計(jì)
根據(jù) GenBank 中的衣原體 MOMP 基因序列(GenBank: L25436.1; G1: 457203)，根據(jù) LAMP引物設(shè)計(jì)的原則，在這些序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物，包括外引物和內(nèi)引物(F3、B3、FIP、BIP)ο External primer F3:5’_ acaagcctag aggatacaag-3;- External primerB3:5’ gttgagcgatgcggatagtg-3 ；FIP:5’ -agtatccgtagcagcctctg gaacgtccg ccaactttcc-3，；BIP:5’ - gtc tagcactctc ttacaga gtgacca gtttacgccaatg -3’。弓I物由大連寶生生物有限公司合成。
[0013]反應(yīng)條件的優(yōu)化
LAMP反應(yīng)在25 PL反應(yīng)體系中進(jìn)行，引物F3、B3分別為1.0 μΚ0.5、1、2 Mmol/L)、引物 FIP、BIP 分別為 2PL (1、2、4 Mmol/L)，DNA 聚合酶(0.5、1、2 U)，LAMP 反應(yīng)緩沖液 13.0KL，模板1.5PL，加入環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法熒光檢測試劑盒中熒光顯色液I μ?，用ddH20補(bǔ)足至25 μ?ο反應(yīng)條件分別為:反應(yīng)溫度(59、62、65°0，反應(yīng)時(shí)間(30、45、60 min)，94°C滅活
2min。同時(shí)以ddH20作為空白對照。通過對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以確定最佳反應(yīng)條件，擴(kuò)增產(chǎn)物用肉眼在日光下直接觀察，或在紫外光下進(jìn)行觀察。
[0014]特異性試驗(yàn)
以衣原體、大腸埃希氏桿菌、銅綠假單胞菌、葡萄菌、魏氏梭菌DNA為模板分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)，用ddH20作為空白對照，以確定建立的LAMP反應(yīng)的特異性。
[0015]敏感性試驗(yàn)
先采用紫外分光光度計(jì)測定DNA含量，I個(gè)0D260值相當(dāng)于50 μ g/mLDNA。取4.3X103pg/L的衣原體核酸，經(jīng)10倍系列稀釋應(yīng)用MOMP基因F3、B3引物進(jìn)行用于LAMP反應(yīng)和PCR擴(kuò)增，以確定建立的LAMP反應(yīng)的敏感性。
[0016]重復(fù)性試驗(yàn)
應(yīng)用建立LAMP方法，重復(fù)檢測衣原體DNA 3次以檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
[0017]對臨床樣品的檢測
對2013年至2015年貴州省內(nèi)養(yǎng)羊場和養(yǎng)羊?qū)I(yè)戶采集的100份可疑病料應(yīng)用建立的LAMP診斷方法進(jìn)行檢測。
[0018]研究的結(jié)果與分析
3.1LAMP檢測方法的建立
LAMP檢測方法反應(yīng)在25 μ?反應(yīng)體系中最佳反應(yīng)條件為，反應(yīng)溫度62°C，反應(yīng)45min，94°C滅活 2 min。引物 F3、B3 (0.5 Mmol/L)各 ?μ?，引物 FIP、BIP (I Mmol/L)各 2μ