抗植物病原性真菌的多肽的制作方法
【專利說明】抗植物病原性真菌的多肽
[0001] 本發(fā)明涉及多肽，其能有效抗真菌，尤其是抗植物致病性真菌，并抗寄居于農(nóng)產(chǎn)品 的真菌。本發(fā)明還涉及制備這種多肽的方法，以及編碼這種多肽的核酸。另外，本發(fā)明涉及 使用本發(fā)明的多肽處理植物的方法和制品，還涉及本發(fā)明的核酸用于生產(chǎn)免受真菌損傷的 作物的用途。
[0002] 真菌對人感染是嚴重的問題，尤其是對于免疫缺陷的患者，因為迄今只知道少數(shù) 可靠的抗真菌活性藥物。最常使用的包括吡咯衍生物，例如克霉唑或酮康唑，與其他化合物 (例如兩性霉素B)相比其低毒，因此經(jīng)常是真菌感染治療的唯一可能。
[0003] 除了在人和動物中的感染，真菌還可造成植物的嚴重損傷。由真菌對作物的感染 所造成的產(chǎn)量損失是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)最為嚴重的問題之一。已知超過8000種真菌可造成植物疾 病。例如，疫霉屬（Phytophthora)造成馬鈴薯植物腐朽，全世界每年因此損失20%的馬鈴 薯收成。特別重要的是鐮刀菌屬（Fusarium)，其侵染谷類植物，例如小麥、玉米和大麥。例 如，禾谷鐮刀菌（Fusariumgraminearum)在這些植物中造成疾病，其表現(xiàn)為莖上的眼點、葉 壞死或根損傷，以及玉米穗腐爛。1992至2001年期間，美國小麥種植中禾谷鐮刀菌造成的 損失總計超過26億美元（Schisleretal.BiologicalcontrolofFusariumheadblight ofwheatanddeoxynivalenollevelsingrainviauseofmicrobialantagonists； AdvExpMedBiol. 2002;504:53-69)。除了對被侵染的谷物造成較高的產(chǎn)量及質(zhì)量損失 外，真菌還造成毒性代謝物（真菌毒素）對谷物的顯著污染，當其被攝取時造成伴隨顯著健 康問題的嚴重中毒（中毒癥）。這繼而導致動物生產(chǎn)領(lǐng)域嚴重的經(jīng)濟損失。迄今已鑒定了 約100種由鐮刀菌產(chǎn)生的毒素，其中來自單端孢霉烯類的脫氧瓜蔞鐮菌醇和瓜萎鐮菌醇是 谷物種植中最重要的真菌毒素。這些蛋白合成強效抑制劑的效果包括皮膚毒性和對高等動 物神經(jīng)及消化系統(tǒng)的不利影響。因此這些物質(zhì)是對人及家畜的重要威脅。
[0004] 基于數(shù)量比例，二硫代甲氨酸酯類和秋蘭姆二硫化物是農(nóng)業(yè)中所用的最重要 的殺真菌劑，其次是吡咯。對二硫代甲氨酸酯類和秋蘭姆二硫化物的使用存在疑慮，特 別是因為其水污染可能性及其較低特異性的作用機制（BayerischesLandesamtfur Wasserwirtschaft,LeafletNo. 4. 5/14,asofJuly25,2005)。吡略例如丙環(huán)唑或滅 菌唑在植物保護中使用的問題主要在于具有相同作用機制（抑制真菌特異性羊毛甾 醇-14a-脫甲基酶）的化學相關(guān)物質(zhì)還用于醫(yī)藥。因此，存在以下危險，即通過環(huán)境中 潛在的人病原性真菌抗性選擇，用于醫(yī)藥的吡略真菌毒素的有效性降低（Reportofthe GermanFederalInstituteforHealth-RelatedConsumerProtectionandVeterinary MedicineofJune7,2001)。盡管對吡咯抗性的形成發(fā)生的相對緩慢，并因此從植物保護 角度被看作是一個中度風險，但即便今日仍認為無法恢復到無抗性情況。然而，吡咯如今被 認為是綜合植物栽培不可或缺的成分。
[0005] 除了對生長作物的侵染，真菌也體現(xiàn)了種子、谷物、果實及其他農(nóng)產(chǎn)品的儲藏和庫 存中的重要問題。真菌寄居不僅導致因產(chǎn)品不得不被丟棄的直接損失，如果被真菌毒素污 染的食物和飼料被攝取，其還具有嚴重中毒的風險。然而，在庫存保護中殺真菌劑的使用 (其原則上可行，并且從經(jīng)濟角度是值得期待的）受到高度限制。在植物保護中，殺蟲劑的 使用和收獲之間通常有足夠的時間間隔，活性物質(zhì)可被降解。相反，對于儲存的作物，其隨 時可能被銷售或消費。因此，由于衛(wèi)生學或毒理學的原因，很多高效殺蟲劑無法用于庫存保 護。其他制品只能降低濃度使用，以符合允許的最高水平。這導致控制成功性的降低以及 不得不重復該措施，這使得從經(jīng)濟的角度講該處理的目的性存在爭議。例如，目前德國和奧 地利并無殺真菌劑獲批用于庫存保護。因此，并無控制儲藏產(chǎn)品中產(chǎn)毒性真菌的令人滿意 的方案。
[0006] 為了改善情況（主要是植物保護領(lǐng)域），對合成低分子量殺真菌劑的各種替代 品進行了研究，部分已投入使用。一種可能是用非毒性土壤真菌對作物植株進行控制性 接種，其與真菌蟲害競爭，通過部分尚未完全研究透徹的機制殺死它們或抑制其生長。真 菌病理學、抗生作用、鐵載體釋放、競爭生境和營養(yǎng)、誘導系統(tǒng)抗性機制及植物生長促進 經(jīng)探討與之相關(guān)。迄今，主要在可可作物處理取得了良好的效果，以控制在南美洲由有 害的可可叢枝病菌（Moniliophthora(可可簇葉病菌同義詞））引起的掃帚病?；谧?座木霉（Trichodermastromaticum)配制的制品于2012年2月在巴西獲批?；诠?生或內(nèi)生木霉屬（T.martiale，T.ovalisporum)的其他制品正處于研發(fā)中，用于抗由棕 櫚疫霉（Phytophthorapalmivora)造成的可可黑色腐敗，以及抗可可鏈疫孢莢腐病菌 (Moniliophthoraroreri)，其為造成可可念珠菌果腐病的病原體。
[0007] 另一種用于控制有害真菌的可能策略（其尚未進入醫(yī)藥或農(nóng)業(yè)實踐）是應用 所謂的抗微生物肽。這些抗微生物肽包括基因編碼的寡肽，其通常由15至45個蛋白 質(zhì)氨基酸以線性鏈連接組成（Zasloff，M.Antimicrobialpeptidesofmulticellular organisms.Nature2002,415:389-95 ；Boman,H.G.Antibacterialpeptides:basic factsandemergingconcepts.JInternMed. 2003, 254:197-215)?？刮⑸镫脑诖?多數(shù)多細胞生物中都已發(fā)現(xiàn)，并且是哺乳動物（包括人）的免疫系統(tǒng)的重要成分?？刮?生物肽對如昆蟲和其他節(jié)肢動物生物的免疫防御至關(guān)重要，這些生物無獲得性免疫系 統(tǒng)。大多數(shù)已知抗微生物肽具有兩親性結(jié)構(gòu)，其中親水部分具有正電荷。這使得肽能 與通常帶負電的細菌膜相互作用，并在包埋入膜內(nèi)后形成孔狀結(jié)構(gòu)。由于真核生物的 膜通常不帶電或僅帶微弱的負電荷，大多數(shù)抗微生物肽的活性主要是抗微生物，其效力 通常對革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌更顯著。一些抗微生物肽，例如殺菌肽、麻蠅毒素 和螫蠅抗菌肽（stomoxyn)(其特征在于a-螺旋結(jié)構(gòu)）顯示廣譜活性，并且不同程度 地具有抗真菌、原生動物和腫瘤細胞的活性。然而，這些抗微生物肽與生物膜的非特異 性相互作用的趨勢也經(jīng)常產(chǎn)生溶血活性并因此對哺乳動物具有毒性。對許多抗微生物 肽實際應用的進一步限制是由于高鹽濃度，甚至經(jīng)常由于150mM的生理NaCI濃度對其 活性的降低(Marretal.Antibacterialpeptidesfortherapeuticuse:obstacles andrealisticoutlook.CurrOpinPharmacol. 2006, 6:468-72)。這是因為與革巴膜靜 電相互作用的中和。對于一些抗微生物肽，已描述了主要的或唯一的殺真菌活性。這 些抗微生物肽包括大臘螟霉菌素（galIerimycin)、夜蛾抗菌肽（heliomicin)、螞蟻 抗菌肽（termicin)、果繩霉素（drosomycin)、PsDl和NaDl(Loboetal.Antifungal PisumsativumdefensinlinteractswithNeurosporacrassacyclinFrelated tothecellcycle.Biochemistry. 2007, 46:987-96；vanderffeerdenetal.The plantdefensin,NaDl,entersthecytoplasmofFusariumoxysporumhyphae.JBiol Chem. 2008, 283:14445-52)。這些抗微生物肽的特征在于由3或4個二硫鍵穩(wěn)定的緊密的 三維結(jié)構(gòu)。具有該結(jié)構(gòu)特征的抗微生物肽被稱為防衛(wèi)素，與其活性范圍或產(chǎn)生其的生物 無關(guān)。Al〇3情況特殊，因為它是唯一已知的僅由3個P鏈組成，而不含其他防衛(wèi)素中所 見a螺旋部分的防衛(wèi)素。對真菌膜的識別不依賴于電荷而發(fā)生，至少在某些情況下通過 與中性葡糖神經(jīng)酰胺的特異性結(jié)合（Aertsetal.Themodeofantifungalactionof plant,insectandhumandefensins.CellMolLifeSci. 2008, 65:2069-79)。進一步描 述了碧蝽金屬肽（metchnikowin)抗真菌，特別是革蘭氏陽性細菌的活性（Levashinaet al.Metchnikowin,anovelimmune-inducibleproline-richpeptidefromDrosophila withantibacterialandantifungalproperties.EurJBiochem. 1995,233:694-700) 〇 該富含脯氨酸的肽由26個氨基酸殘基組成，與典型的抗微生物肽不同，其缺少膜溶解活 性。具有顯著的抗革蘭氏陰性細菌活性的較短的富含脯氨酸的抗微生物肽穿透生物膜而 不破壞該膜，并抑制細胞內(nèi)部的分子伴侶蛋白DnaK(Kragoletal.Theantibacterial peptidepyrrhocoricininhibitstheATPaseactionsofDnaKandprevents chaperone-assistedproteinfolding.Biochemistry. 2001，40:3016-26)。碧疇金屬肽是 否也具有該作用機制并不清楚。
[0008] 殺真菌活性肽在醫(yī)藥和化妝品中的應用看似合理，特別是用于皮膚或粘膜，例如 以粉末、乳劑、凝膠、洗液、香波、噴霧、口腔洗劑或牙膏形式。另外，存在口服或注射的可能， 例如在致命性急性感染的情況下。在植物保護和庫存保護領(lǐng)域也可以外部使用，例如通過 噴霧或應用粉末狀制劑。活性肽制品可合成性產(chǎn)生，主要通過固相合成，或通過相應核酸在 不同宿主生物中的異源表達。由于純的形式的寡肽和多肽制品很復雜，因此有必要尋找可 替換的應用形式，主要用于植物保護中。至少在研究領(lǐng)域得到確認的一種方法是產(chǎn)生基因 改造植物，其中導入編碼待生產(chǎn)的活性肽的核酸。由于在某些情況下不希望植物對該活性 物質(zhì)進行恒定生產(chǎn)，有利的是以如下方式導入核酸，其表達受到啟動子控制，所述啟動子由 真菌感染直接活化，或被與真菌感染相關(guān)的植物的應激反應活化。
[0009] 編碼防衛(wèi)素夜蛾抗菌肽和果蠅霉素的核酸被導入馬鈴薯植物，并能夠介導針對煙 草娃眼?。–ercosporanicotianae)較小但統(tǒng)計上顯著的抗性（Banzetetal.Expression ofinsectcysteine-richantifungalpeptidesintransgenictobaccoenhances resistancetoafungaldisease.P