通過調(diào)節(jié)mir-124分化干細(xì)胞的方法
【專利說明】通過調(diào)節(jié)MIR-124分化干細(xì)胞的方法 奪叉引用
[0001] 本申請(qǐng)要求2012年11月30日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/732, 162和2013年9 月12日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/877, 156的權(quán)益，這兩個(gè)申請(qǐng)均通過引用并入本文。 序列表
[0002] 本申請(qǐng)包含已經(jīng)以ASCII格式電子提交并通過引用全文并入于此的序列表。所述 八5(：11拷貝，創(chuàng)建于2013年11月25日，被命名為44980-703601_5141七并且大小為26,919 個(gè)字節(jié)。
【背景技術(shù)】
[0003]在原腸胚形成期間，上胚層細(xì)胞產(chǎn)生原條中內(nèi)胚層，隨后產(chǎn)生包括定形內(nèi)胚層(definitiveendoderm，DE)在內(nèi)的3個(gè)胚層。DE分化成原始內(nèi)胚層，自此處腹及背胰芽發(fā) 育成胰腺。先進(jìn)的人胚胎干（hES)細(xì)胞研究已經(jīng)激發(fā)了通過DE特化（specification)來 生成感應(yīng)葡萄糖和分泌胰島素的P-細(xì)胞以治療1型糖尿病的愿景。然而，當(dāng)前的hES細(xì) 胞方法耗時(shí)且復(fù)雜。 援引并入
[0004] 本文的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均通過引用并入本文，其程度猶如特別地且 單獨(dú)地指出每個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)通過引用而并入。在本文的術(shù)語(yǔ)與并入的 文獻(xiàn)中的術(shù)語(yǔ)沖突的情況下，以本文的術(shù)語(yǔ)為準(zhǔn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 該
【發(fā)明內(nèi)容】
中提供的本發(fā)明實(shí)施方案僅意在示例性的并意在提供本文所公開的 選擇性實(shí)施方案的概述。
【發(fā)明內(nèi)容】
（其為示例性的和選擇性的）并不限制任何權(quán)利要求的 范圍，并非提供在本文中公開或考慮的本發(fā)明實(shí)施方案的整個(gè)范圍，且不應(yīng)解釋為限制或 約束本公開內(nèi)容或任何請(qǐng)求保護(hù)的本發(fā)明實(shí)施方案的范圍。
[0006]在許多方面的一個(gè)方面，本文提供了一種分化哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞的方法，該 方法包括調(diào)節(jié)miR-124以誘導(dǎo)哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞向分化細(xì)胞的分化。在一種情況下， 該哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞是人滋養(yǎng)層干（hTS)細(xì)胞。在一種情況下，本文的哺乳動(dòng)物滋養(yǎng) 層干細(xì)胞來自嚙齒動(dòng)物（例如，小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠或松鼠）、兔、牛、綿羊、豬、狗、貓、猴、 猿（例如，黑猩猩、大猩猩或猩猩）或人。在一種情況下，該分化細(xì)胞是祖細(xì)胞，例如，胰腺祖 細(xì)胞。在一種情況下，該分化細(xì)胞是多能干細(xì)胞。在一種情況下，該分化細(xì)胞是內(nèi)胚層、中 胚層或外胚層祖細(xì)胞。在一種情況下，該分化細(xì)胞是定形內(nèi)胚層祖細(xì)胞。在一種情況下，該 分化細(xì)胞是胰腺內(nèi)胚層祖細(xì)胞。在一種情況下，該分化細(xì)胞是多能祖細(xì)胞。在一種情況下， 該分化細(xì)胞是寡能祖細(xì)胞。在一種情況下，該分化細(xì)胞是單能、雙能或三能祖細(xì)胞。在一種 情況下，該分化細(xì)胞是內(nèi)分泌、外分泌或管（duct)祖細(xì)胞，例如內(nèi)分泌祖細(xì)胞。在一種情況 下，該分化細(xì)胞是P-細(xì)胞。在一種情況下，該分化細(xì)胞是產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞。在本文公開 的任何方法中可以使用一種或多種分化細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述調(diào)節(jié)激活miR-124。 在一種情況下，所述調(diào)節(jié)在時(shí)間空間上，例如在定形內(nèi)胚層階段在約1小時(shí)至約8小時(shí)之 間激活miR-124。在一種情況下，所述調(diào)節(jié)提升了miR-124表達(dá)。在一種情況下，所述調(diào)節(jié) 使miR-124失活。在一種情況下，所述調(diào)節(jié)降低了miR-124表達(dá)。在一種情況下，所述調(diào)節(jié) 包括使哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞與一種或多種物劑（agent)例如蛋白質(zhì)或類固醇激素接觸。 在一種情況下，所述一種或多種物劑包括生長(zhǎng)因子，例如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF)。在一 種情況下，該FGF是FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9 或FGF10。在一 種情況下，所述一種或多種物劑包括FGF2(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，bFGF)。在一種情況 下，本文中bFGF的濃度不大于約100ng/mL，例如約1至約100ng/mL。在一種情況下，本文 中匕卩6卩的濃度為約：1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、50-70、80-90、或 90-1001^/ mL。在一種情況下，本文中bFGF的濃度為約：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80 或 90ng/mL。在一種情況下，所述一種或多種 物劑進(jìn)一步包括抗氧化劑或還原劑，例如，2-巰基乙醇。在一種情況下，2-巰基乙醇的濃 度不大于約10mm〇l/L，例如約0. 1至約10mmol/L。在一種情況下，2-疏基乙醇的濃度為約 0? 1-1、1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9 或 9-10mmol/L。在一種情況下，2-巰基乙醇的 濃度為約：〇. 2、0. 5、1、1. 5、2、3、4、5、6、7、8或9mmol/L。在一種情況下，所述一種或多種物 劑進(jìn)一步包括維生素，例如煙酰胺。在一種情況下，煙酰胺的濃度不大于約100mm〇l/L，例如 約1至約100mmol/L。在一種情況下，煙酰胺的濃度為約：1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、 50-60、50-70、80-90 或 90-100mmol/L。在一種情況下，煙酰胺的濃度為約：2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20、30、40、50、60、70、80或90mmol/L。在一種情況下，所述調(diào)節(jié)包括使哺乳動(dòng)物 滋養(yǎng)層干細(xì)胞與bFGF、2-巰基乙醇和煙酰胺接觸。在一種情況下，所述一種或多種物劑調(diào) 節(jié)cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白I(CREBl)的活性或表達(dá)水平。在一種情況下，所述一種或多種 物劑調(diào)節(jié)CREBl磷酸化。在一種情況下，所述一種或多種物劑包括維生素代謝物，例如視黃 酸。在一種情況下，所述一種或多種物劑包括CREBl-結(jié)合蛋白。在一種情況下，所述一種 或多種物劑調(diào)節(jié)包括1^111、〇〇^2、〇(^4、3(?17、？(《32或631(30的一種或多種因子。在一 種情況下，所述一種或多種物劑包括外源性miR-124前體或外源性抗-miR-124。在一種情 況下，哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞用外源性miR-124前體或外源性抗-miR-124轉(zhuǎn)染。在一種 情況下，miR-124的啟動(dòng)子的TGACGTCA(SEQIDNO: 158)的順式調(diào)節(jié)元件（CRE)得到調(diào)節(jié)。 在一種情況下，該miR-124 是miR-124a、miR-124b、miR-124c、miR-124d或miR_124e。在一 種情況下，該miR-124是miR_124a，例如智人miR-124a(hsa_miR-124a)。在一種情況下，該 hsa-miR-124 是hsa-miR-124-5p(SEQIDN0:1:CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或其片段。在一 種情況下，該hsa-miR-124 是hsa-miR-124-3p(SEQIDN0:2:UAAGGCACGCGGUGAAUGCC)或其 片段。在一種情況下，該miR-124包含選自表1和表2的序列或其片段。在一種情況下，哺 乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞在調(diào)節(jié)開始后一天內(nèi)分化成分化細(xì)胞。
[0007] 在一個(gè)方面，本文提供了由本文的一種或多種方法分離的一種或多種分化細(xì)胞。 在一種情況下，分離的分化細(xì)胞是人細(xì)胞。在一種情況下，分離的分化細(xì)胞具有正常核型。 在一種情況下，分離的分化細(xì)胞具有一種或多種免疫赦免的（immune-privileged)特性， 例如低或缺乏CD33表達(dá)和/或CD133表達(dá)。本文公開的一種或多種分離的分化細(xì)胞可以 在本文公開的任何方法中使用。
[0008] 在另一個(gè)方面，本文提供了表達(dá)包括Foxa2、Pdxl、Ngn3、Ptfla、Nkx6. 1或其任意 組合的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子的分離的祖細(xì)胞。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞是誘導(dǎo)的多能 干細(xì)胞。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞衍生自哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞，例如hTS細(xì)胞。在一 種情況下，分離的祖細(xì)胞是胰腺祖細(xì)胞。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞是內(nèi)胚層、中胚層或 外胚層祖細(xì)胞。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞是定形內(nèi)胚層祖細(xì)胞。在一種情況下，分離的 祖細(xì)胞是胰腺內(nèi)胚層祖細(xì)胞。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞是多能祖細(xì)胞。在一種情況下， 分離的祖細(xì)胞是寡能祖細(xì)胞。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞是單能、雙能或三能祖細(xì)胞。在 一種情況下，分離的祖細(xì)胞是內(nèi)分泌、外分泌或管祖細(xì)胞，例如內(nèi)分泌祖細(xì)胞。在一種情況 下，分離的祖細(xì)胞是細(xì)胞。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞是產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞。在一 種情況下，分離的祖細(xì)胞來自嚙齒動(dòng)物（例如，小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、松鼠）、兔、牛、綿羊、 豬、狗、貓、猴、猿（例如，黑猩猩、大猩猩、猩猩）或人。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞是人細(xì) 胞。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞具有正常核型。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞具有一種或 多種免疫赦免的特性，例如低或缺乏CD33表達(dá)和/或CD133表達(dá)。本文公開的分離的祖細(xì) 胞可以在本文公開的任何方法中使用。
[0009] 在另一個(gè)方面，本文提供了表達(dá)P調(diào)理素（betatrophin)、P調(diào)理素mRNA、C-肽 或胰島素的分離的祖細(xì)胞，其中該分離的祖細(xì)胞由哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞分化而來。在一 種情況下，分離的祖細(xì)胞來自嚙齒動(dòng)物（例如，小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、松鼠）、兔、牛、綿羊、 豬、狗、貓、猴、猿（例如，黑猩猩、大猩猩、猩猩）或人。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞是胰腺 祖細(xì)胞。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞是人細(xì)胞。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞具有正常核 型。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞具有一種或多種免疫赦免的特性，例如，低或缺乏CD33表 達(dá)和/或CD133表達(dá)。本文公開的一種或多種分離的祖細(xì)胞可以在本文公開的任何方法中 使用。
[0010] 在一種情況下，本文中的分離的祖細(xì)胞是產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞。本文中的一種或多 種分離的祖細(xì)胞可以在本文公開的任何方法中使用。
[0011] 在一種情況下，本文中的分化細(xì)胞是產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞。本文中的一種或多種分 化細(xì)胞可以在本文公開的任何方法中使用。
[0012] 在一個(gè)方面，本文提供了篩選用于治療或預(yù)防疾病的物質(zhì)的方法，該方法包括：a) 使本文的至少一種分離的祖細(xì)胞與所述物質(zhì)接觸；以及b)檢測(cè)所述分離的祖細(xì)胞中至少 一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的水平的變化。在一種情況下，與未與所述物質(zhì)接觸的相應(yīng)的分離的 祖細(xì)胞相比，所述分離的祖細(xì)胞中的至少一種轉(zhuǎn)錄物或蛋白質(zhì)的水平降低。在一種情況下， 與未與所述物質(zhì)接觸的相應(yīng)的分離的祖細(xì)胞相比，所述分離的祖細(xì)胞中的至少一種轉(zhuǎn)錄物 或蛋白質(zhì)的水平增加。在一種情況下，所述疾病是胰島素病癥。在一種情況下，所述疾病是 糖尿病，例如1型糖尿病或2型糖尿病。
[0013] 在一個(gè)方面，本文提供了針對(duì)細(xì)胞的細(xì)胞毒性或調(diào)節(jié)來篩選物質(zhì)的方法，該方法 包括：a)使本文的至少一種分離的祖細(xì)胞與所述物質(zhì)接觸；b)確定由與所述物質(zhì)接觸而引 起的分離的祖細(xì)胞的表型和/或代謝變化；以及c)將所述變化與細(xì)胞毒性或調(diào)節(jié)相關(guān)聯(lián)。 在一種情況下，所述細(xì)胞是產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞。在一種情況下，所述物質(zhì)是藥物。在一種情 況下，所述物質(zhì)是化學(xué)品。在一種情況下，所述物質(zhì)是抗體或其片段。在一種情況下，所述 物質(zhì)被添加到培養(yǎng)基中。在一種情況下，所述方法包括確定所述物質(zhì)對(duì)分離的祖細(xì)胞的生 長(zhǎng)的影響。在一種情況下，所述方法包括確定所述物質(zhì)是否影響分離的祖細(xì)胞的標(biāo)志物或 受體的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，分離的祖細(xì)胞是胰腺祖細(xì)胞。
[0014] 在一個(gè)方面，本文提供了治療或預(yù)防有需要的哺乳動(dòng)物的疾病的方法，該方法包 括將本文的分離的祖細(xì)胞施用至有需要的哺乳動(dòng)物。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞是免疫 赦免的。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞具有低水平的CD33表達(dá)和/或CD133表達(dá)。在一種 情況下，所述施用包括注射、植入或手術(shù)操作。在一種情況下，所述疾病是胰島素病癥。在 一種情況下，所述疾病是糖尿病，例如1型糖尿病或2型糖尿病。在一種情況下，所述有需 要的哺乳動(dòng)物是小鼠、大鼠、豬、狗、猴、猩猩、猿或人。在一種情況下，所述有需要的哺乳動(dòng) 物具有一種或多種與糖尿病相關(guān)的癥狀，例如多尿癥（尿頻）、煩渴（增加的口渴）、多食癥 (增加的饑餓）、體重減輕、視力模糊、發(fā)癢、周圍神經(jīng)病、復(fù)發(fā)性陰道感染、疲乏、創(chuàng)傷或潰 瘍的緩慢愈合及其任意組合。在一些實(shí)施方案中，分離的祖細(xì)胞是胰腺祖細(xì)胞。
[0015] 在一個(gè)方面，本文提供了產(chǎn)生胰島素的方法，該方法包括使哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì) 胞與一種或多種物劑接觸以激活miR-124,從而產(chǎn)生響應(yīng)于葡萄糖刺激而分泌胰島素的分 離的祖細(xì)胞。在另一個(gè)方面，本文提供了產(chǎn)生0調(diào)理素蛋白質(zhì)和/或0調(diào)理素mRNA的方 法，該方法包括使哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞與一種或多種物劑接觸以激活miR-124,從而產(chǎn)生 胰腺祖細(xì)胞，該胰腺祖細(xì)胞產(chǎn)生P調(diào)理素蛋白質(zhì)和/或P調(diào)理素mRNA。在一種情況下， 0調(diào)理素蛋白質(zhì)或P調(diào)理素mRNA在誘導(dǎo)后約12-28小時(shí)期間，例如在誘導(dǎo)后約12-16、 16-20、20-24或24-28小時(shí)期間產(chǎn)生。在一種情況下，分離的祖細(xì)胞是胰腺祖細(xì)胞。在一種 情況下，分離的祖細(xì)胞產(chǎn)生C-肽和/或胰島素。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞 是hTS細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，本文中的哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞來自嚙齒動(dòng)物、兔、牛、綿 羊、豬、狗、貓、猴或猿。在一些實(shí)施方案中，本文中的嚙齒動(dòng)物是小鼠、大鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠或松 鼠。在一些實(shí)施方案中，本文中的猿是黑猩猩、大猩猩或猩猩。在一些實(shí)施方案中，在定形內(nèi) 胚層階段在時(shí)間空間上，例如在定形內(nèi)胚層階段在約1小時(shí)至約8小時(shí)之間激活miR-124。 在一些實(shí)施方案中，提升了miR-124的表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種物劑包括 蛋白質(zhì)或類固醇激素，例如生長(zhǎng)因子。在一些實(shí)施方案中，該生長(zhǎng)因子是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因 子（FGF)，例如FGFl、FGF2(bFGF)、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF8、FGF9 或FGF10。在一 些實(shí)施方案中，所述一種或多種物劑包括bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子）。在一些實(shí)施方 案中，bFGF不大于約100ng/mL，例如約1至約100ng/mL。在一些實(shí)施方案中，在本文所用的 bFGF的濃度為約：1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、50-70、80-90 或 90-100ng/mL。 在一些實(shí)施方案中，在本文所用的bFGF的濃度為約：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80 或 90ng/mL。在一些實(shí)施方案中， bFGF為約10ng/mL。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種物劑進(jìn)一步包括抗氧化劑或還原 劑（例如，2-巰基乙醇）。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種物劑進(jìn)一步包括維生素（例 如，煙酰胺）。在一些實(shí)施方案中，使哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì)胞與bFGF、2-巰基乙醇和煙酰胺 接觸。在一些實(shí)施方案中，2-疏基乙醇的濃度不大于約10mmol/L，例如約0. 1至約IOmmol/ L。在一些實(shí)施方案中，2-巰基乙醇的濃度為約：0. 1-1、1-2、2-3、3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、 8-9或9-10mmol/L。在一些實(shí)施方案中，2-巰基乙醇的濃度為約：0. 2、0. 5、1、1. 5、2、3、4、5、 6、7、8或9mmol/L。在一些實(shí)施方案中，2-巰基乙醇為約lmmol/L。在一些實(shí)施方案中，煙酰 胺的濃度不大于約100mm〇l/L，例如約1至約100mmol/L。在一些實(shí)施方案中，煙酰胺的濃度 為約：1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、50-70、80-90或90-100臟〇1/1。在一些實(shí)施 方案中，煙酰胺的濃度為約：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、70、80或90mmol/L。在一些實(shí)施方案中，煙酰胺為約10mm〇l/L。在一些實(shí)施方案中，使哺乳動(dòng)物滋養(yǎng)層干細(xì) 胞與一種或多種物劑接觸以調(diào)節(jié)CAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白I(CREBl)的活性或表達(dá)水平，例 如CREBl磷酸化。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種物劑包括維生素代謝物，例如視黃 酸。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種物劑包括CREBl-結(jié)合蛋白。在一些實(shí)施方案中， 所述一種或多種物劑調(diào)節(jié)選自mixll、Cdx2、0ct4、Soxl7、Foxa2和GSK30的一種或多種因 子。在一些實(shí)施方案中，本文中的miR-124是miR-124a、miR-124b、miR-124c、miR-124d或 1^尺-1246，例如11111?-1243。在一些實(shí)施方案中，11111?-1243是智人11111?-1243〇1831111?-124&)， 例如hsa-miR-124-5p(SEQIDN0:1:CGUGUUCACAGCGGACCUUGAU)或hsa-miR-124-3p(SEQID N0:2:UAAGGCACGCGGUGAAUGCC)或其片段。在一些實(shí)施方案中，miR-124包含選自表1和表 2的序列或其片段。
【附圖說明】
[0016] 圖IA至圖IC是一組說明從hTS細(xì)胞至胰腺祖細(xì)胞的途徑的圖。圖IA顯示了 在hTS細(xì)胞分化為胰腺祖細(xì)胞期間胰腺的發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的時(shí)程分布圖（time-course profile)。數(shù)據(jù)表示平均值土SD，n= 3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，★?〈0. 05(t檢驗(yàn)）。圖IB顯示了 在DE形成期間Mixll強(qiáng)度的變化。圖IC顯示了中內(nèi)胚層分離成兩個(gè)細(xì)胞群體：一個(gè)表達(dá) 針對(duì)中胚層的Pdxl+Mixll+，而另一個(gè)表達(dá)針對(duì)內(nèi)胚層的Pdxl+Mixll。
[0017] 圖2A至圖2C是一組顯示多能轉(zhuǎn)錄因子在胰腺分化中的動(dòng)態(tài)分布的圖。圖2A顯 示了獨(dú)特的多能轉(zhuǎn)錄因子在各個(gè)階段特異性細(xì)胞階段的轉(zhuǎn)變。數(shù)據(jù)表示平均值土SD，n= 3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)，*p〈0. 05(t檢驗(yàn)）。圖2B顯示了在DE的轉(zhuǎn)變期間Mixll、Cdx2和0ct4的 免疫熒光圖像。圖2C顯示了具有DE階段的代表性標(biāo)志物的0ct4的免疫熒光圖像。
[0018] 圖3A至圖3M是一組說明miR_124a的生物起源和多方面功能的圖。圖3A 是DE形成和P調(diào)理素激活的調(diào)節(jié)的機(jī)理圖示。圖3B顯示了隨時(shí)間的推移觀察到的 miR-124a與p-CREBl表達(dá)之間的相關(guān)性，并顯示了活性PI3K/Akt/CREB1信號(hào)傳導(dǎo)途徑靶 向miR-124a的不同位點(diǎn)。圖3C顯示了通過qPCR試驗(yàn)測(cè)定的p-CREBl和miR-124a的平 行表達(dá)，以及通過CREBlChIP與qPCR量化的包含CREBl-結(jié)合位點(diǎn)I(acgccgtcatt，SEQID NO: 148)和位點(diǎn) 2 (ggtgacgtcagc,SEQIDNO: 149)的miR-124-2 和包含CREBl-結(jié)合位點(diǎn) (ggtgacgtcacc，SEQIDN0:150)的miR-124-3的啟動(dòng)子區(qū)。圖3D至圖3F顯示了用于螢 光素酶報(bào)告試驗(yàn)的質(zhì)粒的構(gòu)建：圖3D顯示了針對(duì)包含靶向miR-124a(SEQIDN0:2,以3 至 5 方向呈現(xiàn)）的共同結(jié)合位點(diǎn)SmacM(I) (5' -guuuguccagugccuuu-3'，SEQIDNO: 151) 和Smad4(2) (5' -auccagaauugccuua-3'，SEQIDNO: 152)的Smad43'UTR的pGL4. 51-Luc 報(bào)告構(gòu)建體；圖 3E顯示了針對(duì)革巴向hsa-miR_124a(5' -cguguucacagcggacc-3'，SEQID N0:154，SEQIDN0:1 的片段）的Cdx23'UTR(5'-gggaguauuugaacaca_3'，SEQIDNO=I53) 的pGL4. 51-Luc報(bào)告構(gòu)建體；圖 3F顯示了針對(duì)革巴向miR_124a(5' -uaaggcacgcgguga-3'，S ￡〇1〇勵(lì)：156,5￡〇1〇勵(lì)：2的片段）的651(303'1711?(5'11111耶8&8耶(^1111(3-3'，5￡〇1〇 NO: 155)的pGL4. 51-Luc報(bào)告構(gòu)建體。數(shù)據(jù)表示為平均值土SD，n= 5，*p〈0. 05(t檢驗(yàn)）。 用非特異性shRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用作陽(yáng)性對(duì)照?？蛰d體用作陰性對(duì)照。圖3G顯示了miR124a 或抗-miR-124a的預(yù)轉(zhuǎn)染對(duì)誘導(dǎo)后的Smad4、Mixll、Cdx2、GSK3P和0ct4的表達(dá)的影響。 圖3H顯示了 0ct4靶向基因Soxl7以在4hr時(shí)產(chǎn)生Soxl7(箭頭）。輸入：陽(yáng)性對(duì)照，IgG: 陰性對(duì)照。圖31顯示了在ChIP試驗(yàn)中P-聯(lián)蛋白革巴向基因Foxa2 (cctgtttgttttagtt,SEQ IDN0:157)以明顯地產(chǎn)生Foxa2(4hr)(箭頭）。輸入：陽(yáng)性對(duì)照，IgG:陰性對(duì)照。圖3J-M 顯示了P調(diào)理素的合成和調(diào)節(jié)：圖3J顯示了根據(jù)ChIP試驗(yàn)，F(xiàn)oxa2靶向基因C19orf80以 產(chǎn)生P調(diào)理素（箭頭）；圖3K顯示了根據(jù)qPCR分析，P調(diào)理素mRNA在16hr時(shí)瞬時(shí)升高 (相對(duì)于甘油醛-3-磷酸脫氫酶進(jìn)行歸一化）。圖3L是一組Western印跡數(shù)據(jù)，顯示0 調(diào)理素、C-肽和胰島素之間的平行相關(guān)性。數(shù)據(jù)表示為平均值土SD，n= 3, *p〈0. 05 (t檢 驗(yàn)）。圖3M顯示了通過24hr誘導(dǎo)的P調(diào)理素和胰島素的免疫熒光共表達(dá)。
[0019] 圖4A至圖4E是一組顯示hTS細(xì)胞衍生的胰腺祖細(xì)胞的特性的圖。圖4A至圖4C 顯示了體外功能性葡萄糖刺激試驗(yàn)。圖4A顯示了根據(jù)ELISA測(cè)定，細(xì)胞響應(yīng)于高葡萄糖濃 度（15mM，灰柱）以產(chǎn)生免疫反應(yīng)性胰島素。圖4B是一組圖像的代表性摘錄，顯示由計(jì)算 機(jī)-顯微鏡-視頻系統(tǒng)（Olympus,IX-81，DP30,MIU-IBC-IF-2)記錄的形態(tài)變化和陽(yáng)性DTZ 染色。圖4C顯示了根據(jù)放射免疫測(cè)定，高葡萄糖（25mM)刺激分別以7.6ng/hr/106個(gè)細(xì)胞 產(chǎn)生C-肽（以上方的線表示）并以393. 8yIU/hr/106個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生胰島素（以下方的線表 示）。數(shù)據(jù)通過曲線下面積來測(cè)量并表示為平均值土SD，n= 5. *p〈0. 05(t檢驗(yàn)）。圖4D 是高葡萄糖刺激后葡萄狀細(xì)胞團(tuán)的一組超結(jié)構(gòu)顯微照片。在中間圖像中的白色箭頭：橋粒 接合點(diǎn)。底部的箭頭：0 -胰島素顆粒（0 -G)。兩個(gè)上部箭頭：a-胰高血糖素顆粒（a-G)。 N:核。Im-G:未成熟顆粒。M:線粒體。RER:粗糙型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。圖形比例尺：lym。圖4E顯 示了在hTS細(xì)胞中bFGF誘導(dǎo)后24hr時(shí)胰腺祖細(xì)胞標(biāo)志物的免疫熒光染色。對(duì)照染色未示 出。
[0020] 圖5是一張條形圖，其顯示通過免疫熒光試驗(yàn)測(cè)